[发明专利]一种抗沙门菌单链抗体与跨膜蛋白融合蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于制备抗沙门菌单链抗体和跨膜蛋白的融合蛋白的方法。本发明还涉 及包含所述融合基因的表达型重组体、包含所述表达型重组体的工程菌、由此工程菌表达和 分离纯化的目的融合蛋白scFvLH-pVIII(和scFvHL-pVIII)以及此融合蛋白用于沙门菌属的 临床检验诊断以及食品卫生诊断。

背景技术

伤寒沙门菌作为引起食物中毒和肠道腹泻的主要病原菌之一，由其引起的伤寒病已被我 国《传染病防治法》规定列入乙类传染病之一。目前伤寒沙门菌的实验室诊断现仍以检出病 原菌为主要依据，其检测程序包括标本采集接种、分离培养、生化鉴定，血清学分型等多个 环节。最快也要一到二天才能作出最终检验诊断。而近年来报道的一些快速检验诊断方法， 如PCR、ELISA、免疫荧光球法、SPA法，以及利用基因芯片技术等进行伤寒沙门菌的快速 检测，大多需要数小时才能得到结果，并且对伤寒沙门菌有量的要求，还需配备专门人员， 一定的仪器设备。故非常不适用于现场的快速检验、早期排查和诊断。

聚丁二炔脂质体纳米囊泡(或LB膜)已被证明在外界的轻微揉动下，会发生从蓝色向 红色的色变现象，色变迅速，在2-5分钟内可以完成反应，研究表明色变的程度与外界揉动 程度成正相关。单克隆抗体(单抗)具有高度特异性，可以专一地与特定的抗原结合。将单 克隆抗体应用于临床检验诊断，可以提高诊断的特异性，有效减少假阳性率，有助于提高临 床诊断的准确性。在抗沙门菌的单克隆抗体尾端利用DNA重组技术修饰上跨膜蛋白，人工 添加疏水尾端，可以使其通过疏水相互作用插入到类生物膜聚丁二炔脂质体纳米囊泡(或LB 膜)中，制成沙门菌快速检测传感器，可用于沙门菌的检验检疫及临床诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种与沙门菌属O抗原结合，并能插入类生物膜聚丁二炔纳米囊泡 中的scFvHL-pVIII双功能融合蛋白，为提供一种快速检测沙门菌的方法。

本发明还提供了包含scFv-pVIII融和基因重组体的构建，以及含该基因的表达型重组体 的工程菌的发酵培养，更重要的是还提供了重组scFv-pVIII融合蛋白的大规模制备、纯化的 技术路线。本发明的重组scFv-pVIII融合蛋白可在大肠杆菌中发酵生产，通过Ni-琼脂糖凝胶 亲和层析、凝胶过滤层析两步法，可以非常简单，低成本的，快速大规模的得到目的蛋白。 本发明的技术方案可以通过下述方法和步骤实现：

1.抗沙门菌属O抗原单链抗体scFv轻链VL、重链VH以及M13丝状噬菌体主要衣壳蛋白 pVIII的克隆

利用化学合成的方法合成抗沙门菌属O抗原单链抗体的轻链VLcDNA和重链VHcDNA 以及M13丝状噬菌体主要衣壳蛋白的成熟肽编码DNA，并将其分别克隆到pMD18-T载体中， 分别记为pMD18-T-VL、pMD18-T-VH和pMD18-T-pVIII。

2.构建scFv-pVIII(包括scFvLH-pVIII和scFvHL-pVIII)融和基因

通过Swiss-Model同源建模进行scFv的三维结构预测，综合M13丝状噬菌体pVIII蛋白 的X-射线衍射晶体图，在scFv和pVIII加入一段GGGGS连接肽，以使两部分的空间构像不 至于相互影响。设计引物，用一段编码(GGGGS)3的linker序列，经重叠延伸拼接PCR的 方法将抗体VH、VL cDNA拼接成5’-VL-Linker-VH-3’片段，即scFv LH，亦可拼接成 5’-VH-Linker-VL-3’片段，即scFvLH。同样用一段编码(GGGGS)3的linker序列，经重 叠延伸拼接PCR的方法构建scFv-pVIII融合基因，并将scFv-pVIII融和基因克隆至pMD18-T 中，构建pFUS-scFv-pVIII质粒(记为pFUS)。

3.构建包含scFv-pVIII融合基因的重组体

分别设计上下游引物扩增scFv-pVIII融合基因，经双酶切回收产物片段后插入到经相同 两个酶酶切的表达载体中。构建包含scFv-pVIII融合基因的重组体经内切酶谱分析和DNA序 列分析证实序列正确，融合基因读码框插入正确，整个基因939bp，编码313个氨基酸。