[发明专利]一种玉米品种真伪快捷鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，涉及一种玉米品种真伪快捷鉴定方法，具体而言是一种利用SSR分子标记进行玉米品种真伪快速鉴定的方法。

背景技术

植物新品种知识产权保护是鼓励品种培育人不断培育新的品种(系)或杂交种的积极性的有力措施。发展高区分力的鉴定玉米材料技术对玉米的真伪鉴定乃至新品种注册、产权登记保护等都是十分必要的。

理想的品种鉴定技术不但要准确、可靠，还要简单、快速、经济，这是品种鉴定实现产业化的前提。传统的同工酶和蛋白电泳技术形态鉴定方法，产生的多态性有限，且对亲缘关系较近及遗传基础复杂的材料难以鉴别。SSR分子标记是近年来发展起来的建立在PCR基础上的新型DNA指纹技术。SSR标记的等位基因变异来源于基因组DNA复制时的滑动、不对称交换等原因引起的重复序列的变化，因而表现出高度的多态性。同时，该遗传标记具有直接以DNA表现、标记数量多、遗传稳定、不受环境影响等优点，再加上检测快捷，简便，稳定，成为玉米品种鉴定的首选方法。

根据SSR分子标记建立的玉米指纹图谱库可直接对市面上出现的疑似亲本品种，做真伪鉴定。另外，玉米籽粒的果皮是全部继承母本遗传信息的F1代组织，分离并提取果皮基因组DNA，利用SSR分子标记技术即可获得杂交种的亲本母本信息及相应的父本信息，因此可判断该品种在选育过程中是否使用了已申请保护的品种，使品种所有权人的合法利益得到有效维护。

利用SSR对玉米品种进行真实性鉴定，国内外有报道，如中国专利200310117180.3及20061006573.4，但现有技术操作过程繁琐、费时，针对此问题，本发明人重新筛选了引物，采用优化了TouchDown PCR程序及DNA提取方法。发展了一套适合的分子标记，建立了一种玉米品种真伪快速鉴定方法，可用于主要商业用自交系的品种鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快捷、操作简单的玉米品种真伪鉴定方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种玉米品种真伪鉴定方法，该方法采用单粒干种子的胚提取待检样品的基因组DNA；PCR扩增中使用了如下20对核心引物：bnlg1866，phi001，bnlg1017，umc1042，phi029，bnlg1108，bnlg2162，umc2188，bnlg1006，bnlg602，umc1023，phi031，umc1406，bnlg1792，bnlg1131，dupssr14，umc1636，bnlg1129，phi041，umc1291。

其中，用单粒干种子的胚提取待检样品的基因组DNA方法如下：取干种子的2/3胚放入离心管中，加入150μL 0.1mol/L NaOH，沸水中放置5min，冷至室温后加入150μL 1×TE(pH 2.0)缓冲液，吸打混匀后4℃放置。

本发明使用上述的20对核心引物，在体外扩增多态性特征谱带时采用TouchDown PCR程序。

PCR扩增在普通PCR仪上进行即可，TouchDown PCR程序可采用其它程序，但为快速达到本发明目的，本发明优选的TouchDown PCR程序如下：94℃预变性5min，94℃ 1min，67℃ 50S、每个循环降低1.5℃，72℃延伸1min6个循环；然后，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸45min，共30个循环；72℃ 10min。

本发明的玉米品种真伪鉴定方法有如下优点：

1、在提取待检样品基因组DNA的方法时，采用了单粒干种子的提取方法。与常规的叶片提取方法相比，该方法省去了材料发芽的时间，历时短，操作步骤简单，方便快捷，而且所提基因组质量高且稳定，特别适宜大量样品的材料鉴定(一小时内能完成100粒种子的DNA提取)。

2、PCR扩增采用的是优化的TouchDown PCR程序。

其中，PCR程序中所用的20对引物是发明人在大量实验的基础上筛选得出，这些引物多态性丰富，带型稳定，均匀分布在染色体的10条染色体上，而且特征谱带大小均匀分布在50—400bp之间。

另外，利用SSR检测其多态性，采用touch-down PCR技术，可避免各个引物都要调PCR反应参数，设计引物时无需按照统一的条件设计，无需考虑引物的TM值差异，方便快揵，设计成本大大降低。

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式