[发明专利]一种肠道病毒的免疫荧光层析检测试纸及其制备方法

权利要求书

1.一种肠道病毒免疫荧光层析快速检测试纸，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、标记抗体垫、反应膜和吸水垫，其特征在于所述标记抗体垫包埋有一种或多种肠道病毒的荧光标记单克隆抗体；所述反应膜上具有一条或多条检测带和一条质控带，每条检测带上固定有一种肠道病毒的单克隆抗体，检测带的条数以及固定的肠道病毒单克隆抗体与标记抗体垫包埋的标记抗体相适应，质控带固定有能与荧光标记单克隆抗体特异结合的抗抗体。

2.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的肠道病毒单克隆抗体为轮状病毒单克隆抗体、肠道腺病单克隆抗体、星状病毒单克隆抗体或诺瓦克病毒单克隆抗体中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述的抗抗体为羊抗鼠IgG抗体。

4.如权利要求1所述的检测试纸，其特征在于，所述反应膜为硝酸纤维素膜。

5.如权力要求1所述，其特征在于，所述荧光标记单克隆抗体的标记荧光素为Molecular Probes公司的Alexa Fluor系列荧光素或安玛西亚公司的花青素Cy系列荧光素。

6.如权利要求2～5任一项所述的检测试纸，其特征在于，制备轮状病毒单克隆抗体的免疫原为轮状病毒VP6蛋白；制备肠道腺病毒单克隆抗体的免疫原为腺病毒40/41型六邻体蛋白；制备星状病毒单克隆抗体的免疫原为I型星状病毒CP蛋白；制备诺瓦克病毒单克隆抗体的免疫原为诺瓦克病毒VP1蛋白。

7.一种制备权利要求1～6任一项所述试纸的方法，其包括如下步骤：

1)在反应膜的不同位置上按照抗体的种类分别固定肠道病毒单克隆抗体以及抗抗体，形成检测带和质控带；

2)制备标记抗体；

3)组装底板、样品吸收垫、标记抗体垫、反应膜和吸水垫，并在标记抗体垫中包埋标记抗体。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，标记单克隆抗体的制备方法是：将纯化的肠道病毒单克隆抗体用0.1M碳酸氢钠溶液4℃透析过夜，抗体浓度控制在5-20mg/ml；荧光素用二甲基甲酰胺或二甲基亚砜溶解，浓度为10mg/ml；将溶解后的荧光素加入透析后的单克隆抗体，在室温条件下磁力搅拌1小时，荧光素与单克隆抗体的质量比为1∶10～20；反应后用1.5M羟胺氯化物终止反应，抗体荧光素标记过程完成；用Sephadex G25凝胶柱将抗体荧光素标记物进行纯化，得到纯度高的单克隆抗体荧光素标记物。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，标记单克隆抗体的制备方法是：将荧光微球用50mM pH6.0MES缓冲液透析，浓度调整到10mg/ml，体积20ml；配制9.38％的碳二亚胺的MES缓冲液和10％的NHS的MES缓冲液；20ml微粒加入NHS溶液7.2ml，EDAC溶液1.6ml，用MES缓冲液补充体积到40ml，37℃不断旋转反应1个小时；取上述活化荧光微粒20mg，用50mM pH 8.0磷酸缓冲液离心洗涤，并且浓缩成1ml；加入肠道病毒单克隆抗体4mg，并补充体积到2ml，使最终反应浓度为：荧光微球10mg/ml、抗体2mg/ml，37℃旋转反应4个小时；停止反应，将反应后荧光微球12000rpm 4℃离心30分钟，弃去上清，沉淀物用50mg/ml牛血清白蛋白稀释，超声波处理。