[发明专利]一种α－酮戊二酸高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α－酮戊二酸

说明书

技术领域

一种α-酮戊二酸高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α-酮戊二酸，属于生物工程技术领域，特别是一株高产α-酮戊二酸的解脂亚洛酵母。

背景技术

α-酮戊二酸，又称α-胶酮酸，2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，是三羧酸(TCA)循环中重要的中间产物之一，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，也是合成多种氨基酸、蛋白质的重要前体物质。其结构式为：

                    α-酮戊二酸结构式

α-酮戊二酸在医药、有机合成、营养强化剂等领域有着重要的应用前景，目前主要应用领域为：作为运动营养饮料的成分；有机中间体；生化试剂和测肝功能的配套试剂；体格增强补剂；降低术后患者和长期病人的机体损耗；在脑部作为酪氨酸和谷氨酸的前体；同时研究还表明，α-酮戊二酸具有抗氰作用，与亚硝酸钠、硫代硫酸钠配合使用可提高抗氰能力，且有抗惊厥作用。α-酮戊二酸目前主要消费于医疗机构，用来诊断和对神经疾病进行治疗。

随着α-酮戊二酸应用范围不断扩大，α-酮戊二酸的市场需求也在不断增长。但是目前α-酮戊二酸的生产主要还是采用有机合成方法，包括一系列复杂的化学合成过程，这在原料来源和安全生产上存在一定的问题，主要是存在爆炸的危险。所以开发一种利用微生物发酵生产α-酮戊二酸的高效安全的方法很重要。发酵法生产α-酮戊二酸的研究最早始于1946年，当时Lockwood和Stodola对利用细菌生物合成α-酮戊二酸进行了初步的研究。之后Asai等人发现假单胞菌属、产气杆菌和粘质沙雷氏菌可以过量合成α-酮戊二酸，并且提出过量合成α-酮戊二酸的必要条件是培养基中碳源、氮源的浓度。上世纪60年代中期，T.VFinogenova等人在利用解脂亚洛酵母发酵生产单细胞(SCP)蛋白的过程中发现了该酵母也具有过量合成有机酸(α-酮戊二酸、2-羟基酮戊二酸、柠檬酸等)的能力。在硫胺素(一种该酵母菌不能合成，但对于α-酮戊二酸脱氢酶活性是必需的维生素)缺乏的情况下，解脂亚洛酵母可以利用烷烃分泌大量的α-酮戊二酸。

目前对发酵法生产α-酮戊二酸研究较多的是俄国的一个微生物生化和生理研究所。该研究所发现不同种属的硫胺素缺陷型酵母可能都有生产α-酮戊二酸的能力，合成α-酮戊二酸的主要条件就是硫胺素缺乏引起的生长限制。

1999年，T.V.Finogenova等人利用Yarrowia lipolytica VKM Y-2373的突变菌株N1在以乙醇为碳源的培养基上通过调节硫胺素的添加量、氮源、溶氧以及pH值等条件使得α-酮戊二酸的产量达到49g/L，对乙醇的产率是42％。并且确定了生产α-酮戊二酸的最重要条件是由硫胺素缺乏引起的生长限制和过量的氮源(碳源不足时，碳源流向柠檬酸合成)。并且在基于对乙醇代谢和α-酮戊二酸合成途径中关键酶活性的分析中，初步肯定了α-酮戊二酸的合成与氮源代谢之间具有密切的关系。后来又以Yarrowia lipolytica自然菌株为生产菌，在以石蜡为碳源的培养基上得到了109g/L的α-酮戊二酸，产率为120％。

目前国内对发酵法生产α-酮戊二酸的研究很少，仍处于研究的初步阶段。

发明内容

本发明的目的是提供一种α-酮戊二酸高产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产α-酮戊二酸。

本发明的技术方案：一种α-酮戊二酸高产菌，分类命名为解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)WSH-Z06，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M207143。

解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143的筛选方法，从炼油厂附近的土壤中经对照在完全培养基、基本培养基和补充培养基平板上菌落生长情况筛选出硫胺素营养缺陷型的菌株，然后对初筛出的硫胺素缺陷型菌株采用一级发酵逐一摇瓶培养，发酵液利用硅胶层析方法分析，将保留有α-酮戊二酸显色斑点的菌株再转接于装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵复筛，发酵液经高效液相方法测定，比较α-酮戊二酸产量高低而得到高产α-酮戊二酸的菌株。

一种α-酮戊二酸的生产方法，采用解脂亚洛酵母CCTCC NO：M207143为出发菌株，经种子培养和液体发酵生产α-酮戊二酸；

(1)种子培养：

种子培养基以g/L计：葡萄糖20，蛋白胨10，七水硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1，pH 5.5；

培养条件：温度28℃、摇床转速200rpm条件下，培养20-24h；

(2)液体发酵培养：