[发明专利]一种快速定量线虫死亡率的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速定量线虫死亡率的新方法，以及这种方法在药物筛选、农药筛选、环境评价、水质评价等方面的应用，属于模式生物的应用领域。

背景技术

秀丽隐杆线虫(C.elegans)是一种生长在土壤中的线虫，以细菌为食，很容易在实验室培养。成虫体长1mm，且通体透明，在显微镜下易于观察。L₃～L₄期对外界敏感。从一个受精卵发育成可以产卵的成虫，它只需要3天。在自然状态下，秀丽隐杆线虫绝大部分个体为雌雄同体，其一生能产生约300个受精卵，如果在一个培养皿上放上几只线虫，几天之后就可得到大量的后代^[1]。上述这些特点使得秀丽隐杆线虫在很多方面都有应用^[2]。

厦门大学柯翎等人^[3]以秀丽隐杆线虫作为重金属污染的指示生物，研究了Cu²⁺，Cd²⁺，Pb²⁺，Zn²⁺等4种重金属离子对秀丽隐杆线虫的毒性，发现重金属离子浓度越高，毒性越强，线虫死亡率越高。在高浓度组中线虫的中毒反应较迅速，短期内就出现死亡；而在低浓度组，中毒反应较缓慢，经较长时间才出现死亡，对照组相对其他各组，存活时间最长。北京师范大学的鄢雯等人^[4]将秀丽隐杆线虫用于环境水质的监测，同样发现秀丽隐杆线虫存活率与水样毒性之间存在紧密的关系，水样毒性越大，线虫死亡率越高，因此可用秀丽隐杆线虫的存活率评价饮用水源水和水厂工艺水水样毒性。王晓等人^[5]也将秀丽隐杆线虫用于对造纸厂废水中酸碱类毒物的追踪。实验显示，用秀丽隐杆线虫指示重金属危害、水样毒性大小等既降低了实验成本，又提高了检测效率，所以利用其作为环境评价、水质评价的指示生物具有可观的应用前景。

万树青等人^[6]用秀丽隐杆线虫的死亡率来评价棉酚，克线磷，甲基异柳磷，氧乐果，灭多威，硫酸铜等多种农药的杀虫效果，取得了理想的效果。实验显示：棉酚对秀丽隐杆线虫的击倒率强于其他几种杀线剂，克线磷次之，其它几种农药对秀丽隐杆线虫的击倒率都从实验结果上可以清楚的看到。这个结果与运用蚕蛾作为实验对象的研究结果是一致的^[7]。国外将秀丽隐杆线虫用于体内驱虫药物药效筛选的研究已有相关的文章发表^[8]，为驱虫药的体外研究提供了可行方法，并且呈现良好的选择性、准确度及重复性，而且成本低廉。这些研究表明，线虫死亡率的大小反应了的供试物的药效和毒性的大小，因此，线虫死活的判断就成为这类研究的重要实验指标。

判断线虫死活的传统方法是体态法。即死的线虫多呈僵直状态，而活的体态弯曲，一般盘卷或蠕动。但是这种方法对呈不活跃和麻痹状态的线虫是不适用的，此时只能用铂丝来触拔线虫以引起线虫运动来鉴别其死活，因此这种方法费时、费力，工作量极大。为了改变这种状况，万树青等人^[6]试图通过染色方法来区分死活线虫从而测定被测物杀线剂的活性，他们比较了中性红，甲基蓝，番红花红，曙红等4种染料的染色效果，发现这4种染料都能使死亡线虫着色，而活线虫不着色，番红花红效果最好。但是这种方法仍然需要在显微镜下一一计数，工作量依然很大。

美国专利(专利号为20060191023)公开了一种应用荧光染色剂法来鉴别死活线虫的染色方法。这种方法已用于驱虫药物的筛选研究，由于染色后活的线虫无荧光，而死亡的线虫有荧光，利用测试荧光强度的大小来确定线虫的死亡率，这样为高通量筛选提供了保证，但此法对设备要求依然较高，难以在普通实验室得以推广和应用。

由于线虫自身有重量，在水溶液中很快下沉，所以上面所提的荧光高通量筛选方法存在另一个限制点：即多孔板中每一个孔中供试线虫的数量难以掌握。美国专利(专利号20030154501)用一定浓度的PEG8000、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油溶液，可使线虫均匀分布于溶液中，以保证线虫均匀加入多孔板，使供试线虫数量可控。但是上述药品价格偏高且对线虫具有一定的毒性。

鉴于现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种简单易行、成本低廉的快速定量线虫死亡率的新方法，可以方便地应用于新药筛选、农药筛选、环境评价水质评价等方面。

参考文献：

1.庞林海等，秀丽隐杆线虫的培养与保存方法，浙江农业学报，2007，19(1)：34～36.