[发明专利]家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用

权利要求书

1.一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于：将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽；具体的分离步骤如下：（1）透析：将浓缩的抗菌肽粗提液用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析过夜，其间换掉外液两次；取内液用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，-20℃保存备用；（2）固相萃取：取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C₁₈Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸溶液分步洗脱，流速为1ml/min；各洗脱组分冷冻干燥除掉甲醇和三氟乙酸后，超纯水溶解，检测该洗脱组分的抗菌活性；收集、浓缩、冻干具有活性的组分，超纯水溶解，12000rpm离心10min，收集上清液-20℃保存备用；（3）超滤：将固相萃取活性组分合并后加到截留分子量为3KD的超滤管中，5000×g离心30min分离；继续将未透过超滤管的组分加到截留分子量为30KD的超滤管中，同上离心，分别收集超滤管中和管下液体，将活性物质分为三个部分：分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各组分检测蛋白浓度和抗菌活性；（4）反相高效液相色谱纯化：超滤后分子量为3～30KD的活性组分用0.22μm微孔滤膜过滤, 100μl上C₁₈反相色谱柱，流动相A：0.1％三氟乙酸-水溶液；B：0.1％三氟乙酸-甲醇溶液；色谱柱用5%甲醇-0.1%三氟乙酸溶液平衡，洗脱条件为：梯度洗脱，30min内已腈浓度从5％上升到60％；流速1ml/min，手工收集214nm波长洗脱峰，即获得两个抗菌肽组分。

2.按照权利要求1所述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于：所述的抗菌肽粗提液，即家蝇幼虫外分泌物粗提液的制备为：取三龄家蝇幼虫置于干净大烧杯中，充分清洁体表后浸于适量蒸馏水中4小时，不时振摇；吸取浸液离心10000g×10min，上清液冷冻干燥浓缩, 即得抗菌肽粗提液，4℃保存备用。

3.按照权利要求1所述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于：所用的Sep-pak C₁₈Cartridge固相萃取小柱在加样前预用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸－水平衡；所用的C₁₈反相色谱柱为Beckman,System Gold,U.S.A.,ODS 0.5μm,0.46×25cm。

4.如权利要求1-3中任一项所述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法分离得到的家蝇分泌型抗菌肽。

5.如权利要求4所述家蝇分泌型抗菌肽在制备提高特异性或非特异性免疫功能、抗细菌感染的药物或保健品中的应用。

6.如权利要求4所述家蝇分泌型抗菌肽在动物饲料或防腐剂中的应用。