[发明专利]动物肝脏中提纯高精度卵磷脂

说明书

技术领域

本发明涉及动物肝脏来源的一类特异性磷脂酰胆碱的分离纯化工艺流程及其对肝损伤的保护作用。

技术背景：

磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)俗称卵磷脂，是真核生物细胞膜的重要组分之一，它不但维持生物膜正常的结构和功能，与细胞的生长、增殖、分化及癌变密切相关，而且其降解产物还参与细胞的信号转导和代谢调控，具有防衰老、降血脂、抗肿瘤、健脑、保肝等多种生理作用。早在70年代，美国就开始把卵磷脂用于保健食品，总销量仅次于复合维生素C和维生素E列第三。

近年来，我国对植物源卵磷脂(大豆)的研究应用较多，但其中磷脂酰胆碱的含量均较低，还处在产品的粗加工阶段；而对动物磷脂的研究和开发较少，动物肝脏卵磷脂(磷脂酰胆碱)的开发几乎还处在空白阶段。另外，磷脂酰胆碱在肝脏中还存在着一条特异性的合成路线，这也预示了其独特生物学功能的存在，所以对其开发应用已迫在眉睫。

常用的PC分离方法主要有超滤法、沉淀法、色谱法、超临界流体法等。其中由于柱色谱法操作简便，成本较低，因而被广泛采用。但以往柱色谱法中采用的洗脱剂如正己烷、氯仿和甲醇等毒性较大，且不适于工业化生产的需要。最近，还有文献报道，使用高分子膜和CO₂超临界萃取精致高精度磷脂酰胆碱，但这该方法生产成本高，设备复杂，不易推广普及。

发明内容

本发明在综合国内外先进工艺的基础上，根据动物肝磷脂各组分不同的物化性能，研究出了以猪肝为原料，应用全溶剂法制备高精度动物肝脏卵磷脂(磷脂酰胆碱)的方法。该方法工艺简单，成本低廉，纯度高，产率高，有着很高的实用和推广价值。

本发明还发现了此法获得的动物肝脏卵磷脂(磷脂酰胆碱)对肝损伤的保护作用，为进一步药物开发奠定了坚实的理论和实验基础。

附图说明

图1是柱色谱法分离纯化动物肝脏卵磷脂的示意图，将一定量肝脏磷脂粗提物(≥0.4g)经滤膜抽滤后，加入到制备好的色谱柱(直径≥15mm)中，打开色谱柱下端的流速控制器，调节流速为1.0～5.0ml/min。在波长203～208nm下检测收集。研究发现，运用本发明选用的柱色谱法，可以得到高产量、高纯度的动物肝脏卵磷脂(磷脂酰胆碱)，克服了以前方法产量少、纯度低、洗脱剂毒性大等不足，为工业化色谱法制备动物肝脏卵磷脂(磷脂酰胆碱)提供了实验依据和技术支持。

图2是四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)测定动物肝脏卵磷对癌细胞增殖的影响。抑制率＝1-实验孔吸光值/对照组吸光值×100％。CBRH7919是大鼠肝癌细胞系，K562是人的白血病细胞株。我们分别用12.5、25、50μmol的色谱纯肝脏卵磷脂处理CBRH7919和K562细胞12和24h，MTT法检测其对大鼠肝癌细胞CBRH-7919增殖的影响，并与K562细胞作了比较。结果提示：(1)不同剂量的PC对CBRH-7919和K562细胞均有一定的抑制作用，但对CBRH7919细胞的抑制作用明显，抑制率超过40％，而对K562的抑制率低于10％；(2)肝脏卵磷脂作用12h和24h对癌细胞生长的影响没有显著的差别。

由此我们推测肝源性的PC对癌细胞的增殖抑制作用可能具有细胞特异性或组织特异性，这可能与肝脏中特殊的PC合成路径与合成的不同PC分子种有关。这种特异性为今后开发保肝、抗肝癌药物或保健品的开发提供一种新的思路。

具体实施方式

将活化的Al₂O₃的悬浊液灌入色谱柱中，用95％乙醇平衡后，上样洗脱，然后旋转蒸发得到高精度磷脂酰胆碱的浓缩液。

利用不同浓度的CCl₄作用HL7702细胞不同时间后，发现CCl₄能够使HL7702细胞存活率降低，谷草转氨酶与谷丙转氨酶的比值增大，诱导细胞发生损伤；CCl4对HL7702细胞的损伤作用呈剂量和时间相关性；观察了不同浓度的PC对15mmol/L的CCl4造成的肝损伤作用24后，对HL7702细胞的保护作用，发现磷脂酰胆碱可以使死亡细胞比例下降；谷草转氨酶与谷丙转氨酶的比值降低。

尽管已经通过具体的实施方案描述了本发明，但某些修改和等效对于精通此领域的技术人员是显见的，且这些变化被认为包括在本发明的范围之内。