[发明专利]缺氧诱导真核基因表达载体及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程，特别涉及一种缺氧诱导真核基因表达载体及其用途。

背景技术

缺氧可引起一系列的生理反应，如诱导与红细胞生成和血管生成相关基因的表达；同时缺氧与许多疾病的发生也存在着密切的关系，如糖尿病性视网膜病、中风、关节炎、缺血性心脏病等。机体对缺氧能够产生反应是由于在哺乳动物体内广泛存在着缺氧诱导因子(hypoxia induciblefactor-1，HIF-1)，缺氧情况下HIF-1生成增加，可作用于靶基因的缺氧反应元件(hypoxia responsive element，HRE)，启动靶基因的转录。利用HIF-1/HRE基因调节系统调节靶基因的转录与表达是近年来的研究热点，并广泛用于以缺氧为特征的疾病的基因治疗研究，如缺血性心脑血管疾病、肿瘤等。

在基因治疗的载体研究中，近年来较为注重组织特异性和基因表达可调性的研究。非可调的基因表达载体，由于基因表达的不可调控，持续基因过表达可能引起一系列副作用，如血管生成因子不可调表达载体，当基因过表达时可引起的副作用有血管瘤、视网膜病、关节炎等，也有引起肿瘤的可能，因此可调控的真核基因表达载体(包括病毒载体和质粒载体)的研究越来越受到重视。

与病毒载体比较，质粒载体结构简单，容易体外构建和大量扩增，使用方便，不产生免疫排斥等不良反应，也可反复使用；肌肉组织具有自主摄取裸DNA的特性，通过肌肉注射的方式可使基因导入体内，方法简便安全，外源基因也可进行有效的表达。1998年Losordo等人采用含hVEGF₁₆₅的质粒载体，直接心肌内注射治疗慢性心肌缺血病人，成功进行了临床I期试验，从而为应用质粒载体进行缺血性疾病(肢体动脉栓塞疾病、冠状动脉闭塞性疾病，脑栓塞疾病等)的基因治疗提供了一条新的治疗途径。

发明内容

本发明的目的是综合利用上述技术，构建了一种缺氧诱导真核基因表达的质粒载体。

本发明的技术内容是：本发明构建了一种缺氧诱导真核基因表达载体。本实验对pcDNA3.1进行了改造，将其增强子用缺氧诱导的增强子替代，构建了缺氧诱导基因表达载体；为了检测缺氧诱导基因表达载体的功能，将hVEGF₁₆₅的cDNA插入到载体中，构建了含hVEGF₁₆₅的缺氧诱导真核基因表达载体p6HRE-hVEGF₁₆₅，并将该载体转入BHK细胞中，用免疫组化的方法检测hVEGF₁₆₅，证明将该载体可表达外源基因；表达hVEGF的BHK细胞在缺氧环境下培养，用ELISA的方法检测培养上清液中hVEGF的含量，结果证明缺氧诱导后hVEGF的表达量增加。将p6HRE-hVEGF₁₆₅用于家兔肢体缺血性疾病的基因治疗，可有效地促进患肢新生血管和侧支循环的形成，使患肢胫动脉压恢复。目前，缺氧诱导基因表达载体可用于缺血性疾病的基因治疗和肿瘤的基因治疗。

具有缺氧反应元件HRE的真核基因质粒表达载体，可在缺氧条件下使基因表达增强，实现目的基因的可控性表达。将促进血管生成的血管内皮细胞生长因子(VEGF)重组到缺氧诱导真核基因质粒载体中，用于缺血性疾病的基因治疗，不仅使用方便安全，也可实现VEGF基因表达的可调性，如在心肌、肢体缺血部位局部注射基因，缺氧诱导VEGF基因高表达，促进血管再生，改善缺血性病变部位的血液供应，从而达到治疗目的；当缺氧情况好转，对基因诱导作用下降，可减轻或避免由于基因过度表达所致的副作用。这样不仅为探索缺血性疾病的基因治疗提供了基础，还为其他与缺氧有关疾病及肿瘤的基因治疗开 辟了新的途径，具有重要的医学研究和临床应用价值。

附图说明

图1是缺氧诱导基因表达载体的构建图；

去掉pcDNA3.1(+)中的启动子和增强子序列，用6HRE-CMV_min取代，构建成缺氧诱导真核基因表达载体。

图2是构建载体过程中应用的载体pEGFP-N1；

图3是酶切鉴定载体p6HRE-hVEGF₁₆₅；

EcoRI：EcoRI双酶切片段为626bp和5105bp

KpnI：KpnI双酶切片段为733bp和4998bp

BamHI：单酶切片段为5731bp

SalI：酶切片段为470bp、733bp、2185bp和2333bp

M1  λDNA/Hind III，DNA分子量标准

M2  200，400，600，800，1200，1600，1800(bp)；DNA小分子量标准