[发明专利]双功能化学化合物、其制备方法、其用于核酸检测的用途和含有该化合物的系统

说明书

[0001]本发明涉及一种双功能的化学化合物、其制备和在核酸检测中的用途以及含该化合物的系统。

发明背景

[0002]通常核酸的检测都是利用所谓的“DNA芯片”进行的，该芯片经得起高通量的检验，而且比传统的DNA印迹或RNA印迹技术更可靠。通常，这种芯片含有数目众多的已知序列的寡核苷酸片段(“探针”)，而且为了提高稳定性，通常优选探针既可以是DNA，也可是被修饰的、对化学和酶降解耐受的寡核苷酸。在分析过程中，将被测试的样品与芯片相接触，使得探针能够与被分析样品的DNA或RNA杂交。接着，通过一些方法，通常是采用插入染料或其它荧光标记的光学方法来检测和定量杂交的核酸。

[0003]但是，该技术需要使用非常昂贵的光学设备和/或荧光标记物。另外，样品中所含的目标DNA的定量检测是很困难的。所以，曾经研究过改进的方法用于在DNA探针上检测DNA链，例如使用双功能化合物的电化学模型。

[0004]目前双功能化合物已被用于DNA的光裂解，它含有两个分子单元-一个被称作“插入”单元(I)，另一个被称作“活性单元”(AD)。通常，单元I经光照射被氧化，从而将一个电子转移到单元AD。然后，氧化的单元I在这个被贡献给了单元AD的电子返回单元I之前被DNA还原。如图1所示，该机制导致了DNA的氧化，并由此将其裂解(J.Joseph，等人，J.Phys.Chem.B(2003)，第107卷，第4444-4450页，以及其参考文献)。

[0005]但是，已经发现一些双功能化合物也可以被用来检测核酸。

[0006]日本专利JP2000-125865描述了一种检测基因的方法，在具电化学特性的插入化合物、即N-N-双[[4-(3-二茂铁酰氨丙基)哌嗪基]丙基]萘-1，4，5，8-四甲酸的存在下，将基因与固定在电极上的DNA探针进行杂交。

[0007]其它的用于电化学检测双链DNA的插入型双功能化合物的例子描述于Makoto Takagi，Pure Appl.Chemistry，2001，第10卷，第1573-1577页，其中插入单元I是萘二酰亚胺，活性单元AD是二茂铁，或者描述于US2002117396中，化合物是N-[3-[4-(3-二茂铁酰氨丙基)哌嗪基]丙基]-1，8-萘酰亚胺。

[0008]在上面提到的双功能化合物中，插入单元I可以吸收环境光。所以，在适当的热力学环境中，这些化合物能够产生光诱导的电子转移过程，而该过程可以导致DNA裂解，如(J.Joseph，N.V. Eldhl，D.Ramaiah，J.Phys.Chem.B(2003)，第107卷，第4444-4450页和其中所含的参考)所描述的DNA裂解方法，导致DNA不能用于接下来的分析或者甚至产生不可靠的分析结果。

[0009]所以，已知的双功能化合物必须是用在保证有适当的光照条件的检测应用中，因此在工业上不适于广泛使用。

发明概述

[0010]因此，本发明的目的在于提供光稳定的适于在核酸分析中使用的  双功能化合物。

[0011]根据本发明，提供了一种双功能化合物，其含有可以插入到核酸的核碱基(B)之间的插入单元(I)和能够发出检测信号的活性单元(AD)以及任选的间隔单元，其中活性检测单元(AD)选自这样的化学实体：该化学实体具有的结构能够与插入单元(I)产生下述电子反应：在氧化反应过程中，由插入单元I确定的半电对I+/I的还原-氧化电位(EI+/I)低于由核碱基B确定的半电对B+/B的还原-氧化电位(EB+/B)，而在还原反应中，由插入单元I确定的半电对I/I_的还原-氧化电位(EI/I)高于由核碱基B确定的半电对B/B-的还原-氧化电位(EB/B-)。

[0012]这种具有插入部分(I)和活性检测部分(AD)的双功能化合物的特殊的设置允许双功能分子与核酸碱基(B)结合，吸收能量并将能量传递给活性检测部分，从而产生可检测的信号。但是，不同部分或化合物的氧化还原电位是被设计好的，这样能量不会传递给碱基但却会传递给活性检测部分，由此避免了通常由骨架裂解导致的DNA结构的改变。因此，双功能化合物可以检测核酸而不会破坏核酸的结构。

[0013]检测器可以带有多个包被有或邻近于一个或多个探针的电极。当探针与目标杂交并与双功能化合物结合时，在该位点电流会升高。电流强度取决于样品中目标核酸的浓度，因此可以对其含量进行测定。可以通过任何方法，举例来说，通过循环伏安法、差量脉冲伏安法和恒电位仪来测量电流强度。