[发明专利]鹿茸胶原的分离纯化制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种顺次采用中性、酸性缓冲液，通过乙醇浸提、回流提取等技术相结合制备鹿茸胶原的分离纯化方法。

背景技术

20世纪60年代以前，常把蛋白质称之为朊，因此把胶原称之为胶朊，意谓胶性的蛋白质。60年代废了朊，称为蛋白质，也就有了胶原之称。有人把胶原蛋白称作水解胶原或水解明胶。在此把水解胶原称作胶原蛋白，是想与胶原有所区别，不要把胶原与胶原蛋白混为一谈。在《胶原蛋白》(化学工业出版社，2001年)一书中，对胶原、明胶和胶原蛋白作了初步的界定，把原本不太明晰或不太引人注意的概念明确了。最近，李国英等的研究工作(李国英等.胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异。四川大学学报(工程科学版)，2005，37(4)：54～58)从三者的性能上进一步确认了他们之间的差异。

胶原是指动物组织器官中存在的一类蛋白质，在提取、分离时，随着方法和条件不同，可以产生胶原、明胶和胶原蛋白三种产物。能被称为胶原的，必须是三螺旋结构没有改变的那类蛋白质，还保留有生物活性。明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物，与胶原一样，由18种氨基酸组成，但已失去了生物活性。胶原变成明胶有三种可能性：①三股螺旋体完全松开，成为三条互不联结的盘曲的肽链，他们的组成和相对分子质量各不相同；②一条肽链完全松开，而另外两条肽链之间的共价键全部断开，但仍有氢键联结；③三条肽链松开后仍有少量氢键联结在一起。

广泛的意义上说，明胶也属于胶原蛋白，只是明胶的分子量比胶原蛋白高一些，而且明胶的肽链之间还有少量氢键。从结构上讲，胶原是具有共价键连接三股α-肽链的蛋白质，明胶是共价键基本被打断、只剩次级键的蛋白质，而胶原蛋白已是基本上不被共价键和次级键束缚、比较自由的α-肽链或是明胶分子的片断。

从性能上讲，胶原能形成膜，膜具有较好的柔韧性、弹性和强度。在模拟生理条件下，胶原溶液放置25min，从其相关吸光度的变化可以观察到胶原分子之间能再度相互连接形成纤维，导致吸光度上升；而胶原的变性产物明胶和降解产物胶原蛋白则不具有这样的性质。明胶和胶原蛋白的三螺旋结构都被破坏，这种破坏是不可逆的，因而丧失了再纤维性。明胶溶液能形成凝胶，加热则液化，降到30℃以下又会成凝胶；明胶也能成膜，但明胶膜较脆，强度比胶原膜差；胶原蛋白不能成膜。细胞生长实验证明，胶原蛋白与明胶一样不具有促进细胞生长的性质，不具生物活性。

国外对胶原类物质提取的研究始于上个世纪40年代，我国对胶原类物质提取的研究更早。但目前实用的提取方法多涉及用酶水解的方法。因此提取出的物质胶原蛋白与明胶相混，而不是胶原。且多不具备生物活性，或者是将非胶原类物质的生物活性，当作是胶原的生物活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的鹿茸胶原的制备方法，其是将鹿茸匀浆液先后经中性、酸性缓冲液、乙醇溶液反复浸提后，再经回流提取，及透析、冻干，从而获得相对鲜鹿茸，收率约为10～15％的鹿茸胶原。经过细胞实验证明，该胶原对大鼠成骨细胞具有增殖作用。

本发明所述的制备方法包括如下步骤：

①鹿茸前处理：取新鲜鹿茸，剥皮，去肉，分成8～10cm长的小段，1～4℃悬挂静止24～36h，将血控净，切成0.5～1cm³小块，1～4℃蒸馏水洗至无血色；

②去除水溶性蛋白：高速组织捣碎机匀浆鹿茸，加匀浆液体积1.5～2倍的含1～3mM β-巯基乙醇和1～3mM EDTA的15～25mM pH7.5～8.3的Tris-HCl缓冲液(或pH7.5～8.3的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液)，搅拌，1～4℃浸提24～36h，4000～5000rpm离心30～50min得上清液和沉淀，沉淀再加其体积1～1.5倍的上述缓冲液，搅拌，1～4℃浸提24～36h，4000～5000rpm离心30～50min，得去除水溶性蛋白的除杂沉淀；

合并浸提上清液可用于制备水溶性鹿茸蛋白；