[发明专利]一种螺原体菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种水生动物的病原微生物，具体为中华绒螯蟹螺原体菌株及其用途。

背景技术

中华绒螯蟹颤抖病是近年来危害我国水产养殖的重大疾病，国内许多学者对此病进行了研究，但结果不尽相同。我们通过病理学、流行病学、细胞生物学及微生物柯赫氏(Koch′s Rule)法则的验证，明确了该病的致病体及其传播途径；运用细胞生物学、微生物学和分子生物学方法鉴定出颤抖病病原体为螺原体类(spiroplasma)微生物(WenWang^*，Bohai Wen，Gail E.Gasparich，Ningning Zhu，Liwen Rong，Jianxiu Chen and ZaikuanXu.A spiroplasma associated with tremor disease in the Chinese mitten crab (Eriocheirsinensis)Microbiology 2004，150：3035-3040)，这是国际上首次在水生甲壳动物体内发现并分离培养出螺原体类菌株，也是水生动物的一种新型病原微生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种水生动物的病原微生物及其用途。

所说的水生动物的病原微生物，它是中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheir sp.Nov)，其保藏号为CCTCC M 207170。

利用中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170，可以进行病原的人工回感实验从而获得供研究用的颤抖病动物模型。

中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170，用于制备水产动物螺原体病免疫检测试剂盒。例如：用中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170制备抗体并用于中国专利申请200710025337.8所说的检测水生动物螺原体的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括包被液、洗涤液、小牛血清、一抗血清、酶结合物工作液(二抗)、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照和酶标板条；所说的显色液分为四甲基联苯胺(TMB)、柠檬酸-磷酸盐缓冲液和双氧水；所说的阳性对照是含水生动物螺原体的样本，阴性对照是不含螺原体的样本，一抗血清为中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170的多克隆抗体，酶结合物工作液为辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG多克隆抗体。

中华绒螯蟹螺原体CCTCC M 207170具有螺原体属微生物的五大生物学特征：滤过性、螺旋性、运动性、无细胞壁及可在人工培养基中生长。在对数生长期表现为典型的螺旋及运动特性，直径0.1-0.2μm，长度不一，最适生长温度为30度，最适pH为7.2-7.6，耐受渗透压范围为0.15-0.7M蔗糖浓度，最高耐盐度为30‰。在最适培养条件下，达对数生长期的时间为24h，生长代谢产酸，随着该病原微生物的繁殖生长，用酚红作指示剂的培养基由红逐渐变橘黄，36-48h达稳定生长期，此时菌液浓度可达10⁸-10⁹/ml。另外，该病原微生物生长需要血清类物质提供营养，能水解尿素，因为缺乏细胞壁而对青霉素等抗生素不敏感。

用病原微生物回感中华绒螯蟹可复制出典型的颤抖病，回感克氏原螯虾也会令其病发致死。

本发明公开了一种水产动物病原体，能用于建立动物模型，用于制备免疫检测试剂盒，用于防治药物筛选等，对水产动物疾病，特别中华绒螯蟹颤抖病的防治起到积极的作用。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

实施例一：菌种的分离、培养、保藏及复壮

1.患颤抖病病蟹中螺原体的分离

病蟹来源：实验中用于分离螺原体的病蟹来源于安徽全椒、江苏的南京、宜兴、溧阳、扬州等地的养殖塘，体重30-100g，经光镜、电镜及分子生物学检测，确诊为颤抖病病蟹。

从病蟹血淋巴液分离螺原体：活体病蟹第三步足基部75％酒精局部消毒，一次性注射器抽取蟹血淋巴液与PBS等体积混匀，用孔径为0.22μm滤器过滤，取5μl滤液负染，电镜观察。

从病蟹组织分离螺原体：病蟹整体75％酒精消毒，解剖，取约0.2g的病蟹组织(肢肌)放入无菌培养皿中，加入PBS缓冲液2mL，用剪刀及牙签将病组织捣碎，静置1h，用孔径为0.22μm滤器过滤。

2.螺原体的人工培养基培养