[发明专利]自身抗体的互补式亲和层析纯化方法

说明书

技术领域

本发明是一种以互补式免疫亲和层析为主要创新点的特异性纯化自身抗体的技术方案，尤其适用于对组织细胞中因组成成份较多而不适宜于用基因工程表达和单克隆抗体亲和层析获得的自身抗原的多克隆抗体纯化，属于抗原抗体制备和检测的免疫学技术领域。

背景技术

在很多人的体内存有自身抗原，它们种类繁多，可以刺激机体免疫系统发生免疫反应，产生针对自身抗原的抗体和致敏淋巴细胞，由此而引起很多的自身免疫性疾病。如何从机体的组织细胞或体液中提取纯化这些自身抗原，在技术上一直有难度，主要问题是获得的抗原特异性不高，不易剔除机体的其他正常组织成分，因此利用这些自身抗原制作试剂盒检测特异性自身抗体时普遍存有很高的非特异性反应，即假阳性较多。如何从机体血清中特异性地纯化这些自身抗原的抗体就更加困难，尤其是针对那些组成成份众多的自身抗原的抗体。由于难以获得特异性和纯度很高的自身抗体的标准品，自身抗体的定量检测就很难进行，因此目前国内外绝大多数自身抗体的定量检测试剂盒都只能半定量，以相对单位数作为机体体液中自身抗体的相对含量，而且各厂家自行定义各自的相对单位数，互不可比。

例如，不孕育症占我国已婚夫妇的8-15％，其中很多夫妇是因为机体对精子抗原和子宫内膜抗原等发生了免疫反应，产生的抗精子抗体和抗子宫内膜抗体能破坏精子和子宫内膜导致不孕，因此检测这些自身抗体的有无和含量是不孕症诊断和疗效观察的重要指标。但是，检测抗体必须要有特异性的抗原。如何纯化精子抗原、子宫内膜抗原等自身抗原呢？近年来国内外文献报道的方法主要有：超声波粉碎、反复冻融破碎精子细胞或子宫内膜细胞等物理方法；化学试剂如LTS、DTT、NP-40及Triton X-100等化学萃取法或胶原酶消化法；基因克隆表达单种精子抗原以及利用单克隆抗体制备亲和层析柱的纯化法等。

后两种方法纯化所得抗原的特异性最高，但是缺点也非常明显。基因工程技术只能克隆表达单一组分的抗原，而很多自身抗原的组成成份繁多，如精子抗原多达100余种，子宫内膜抗原也种类众多，用基因克隆表达的仅包括极少数组分的抗原来检测机体内的抗精子抗体和抗子宫内膜抗体极易导致漏检，因而离实际应用尚远；另一个缺点是很多自身抗原从基因到蛋白质序列都不清楚，不能进行基因克隆表达。利用单克隆抗体制备亲和层析柱进行亲和层析，同样也只能纯化单一组分的自身抗原，而且需要制备单克隆抗体。单抗的制备不但技术繁杂，很多时候无法用含有目的抗原的机体组织细胞或体液作为靶抗原进行单克隆抗体的筛选，从而无法得到单抗，也因此很多自身抗原无法通过单抗的亲和层析法来纯化。物理法和化学法提取的自身抗原纯度较差，极难清除与机体血清中其他成分的非特异性反应。

在自身抗体的纯化方面，国内少有报道，国外主要是制备针对基因工程表达的自身抗原的单克隆抗体。这些单克隆抗体的克隆数有限，大多用于科研中。象其他任何抗体的定量检测一样，抗精子抗体的定量检测也需要有抗精子抗体的标准品。但是人类精子抗原多达数百种，而且大多数未能进行基因确定和克隆表达，因此无法利用基因重组抗原筛选出如此众多的单克隆或多克隆抗体。不同抗原成份诱导产生的抗体，其亲和力差异很大。即使能获得少数几种基因重组精子抗原，其对应的单克隆抗体或者几种单抗的混合物只能与精子的极少数抗原决定簇结合，因此它们在与固相载体上包被的成份和决定簇均相当复杂的抗原结合时，机率很小，同时它们的亲和力也不足以代表体内几百种精子抗原的对应抗体的亲和力。这种亲和力差异将直接导致定量检测结果的不同。相比之下，从抗血清中提取纯化的人工主动免疫或自然免疫状态下产生的多克隆抗体，因其针对的抗原成份和决定簇的多样性和随机性，更能代表定量检测中待测标本中抗体与抗原的结合能力，因此更适合于作为定量检测自身抗体时的抗体标准品。