[发明专利]二粒小麦LRR-受体蛋白激酶基因、该基因的克隆方法及其应用

权利要求书

1.二粒小麦LRR-受体蛋白激酶基因，其特征是其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因编码的蛋白二级结构图如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求1所述基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)以二粒小麦的叶片为材料提取总RNA(核糖核酸)，再进一步分离mRNA(信使核糖核酸)，通过反转录将mRNA转录为cDNA(互补脱氧核糖核苷酸)，用该cDNA为模板进行基因克隆。

(2)根据与植物抗病相关的LRR-类受体蛋白激酶基因序列设计了一对兼并性引物(序列为：5′-GTATTG(A/G)TTTTCTTTGCCTGG(A/C)C-3′；5′-CAAGC(A/C)GT(A/C)CGTCCAATC(T/A)AT-3′)，通过反转录PCR(RT-PCR)技术从二粒小麦cDNA中获得编码序列长度为3081bp的cDNA片段，克隆于pUC18-T载体上，测序后通过序列分析证明这个cDNA克隆编码富亮氨酸区-丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶。

5.根据权利要求4所述基因的克隆方法，其特征在于：

cDNA的合成方法包括：用试剂提取叶片总RNA，用Poly(A)mRNA分离系统III分离出mRNA，用SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒合成cDNA；

反转录PCR合成方法包括：用高保真DNA聚合酶进行扩增，扩增程序为：先在94℃变性2分钟，接30个循环的94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟，最后在72℃延伸7分钟；

产物回收和测序分析：扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳分离。将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切割下来，用液氮反复冻融回收，等体积氯仿抽提纯化，2倍体积的酒精沉淀。回收的DNA片段用超纯水溶解后，用T4-DNA连接酶将其与pUC18-T载体连接，4℃连接过夜，用CaCl₂热击法，在42℃热击90秒，将连接产物转化到大肠杆菌DH10B菌株中，用质粒小量提取法提取质粒DNA，测序仪测序，测序结果进行保守功能域数据分析。

6 根据权利要求1所述的基因在小麦抗白粉病中的应用。

7.根据权利要求1所述的基因在转基因抗病育种中的应用。

8.根据权利要求1所述的基因在转基因抗病育种中的应用。

9.根据权利要求1所述的基因在设计合成新抗病相关基因中的应用。

10.根据权利要求1所述基因在基因芯片制作研究中的应用，