[发明专利]生产紫穗槐－4,11－二烯和青蒿酸的方法

说明书

发明领域 

本发明涉及一种生产紫穗槐-4，11-二烯的方法，具体涉及一种通过代谢工程技术生产紫穗槐-4，11-二烯的方法，以及进一步生产青蒿酸的方法。 

背景技术

青蒿素(artemisinin)是中国科学家自主开发的创新抗疟药，是中国唯一被世界卫生组织(WHO)认可的按西药研究标准研究开发的中药，是中国仅有的两个收入世界药典的中药之一(另一为麻黄素)。近来还发现青蒿素具有抗癌、抗孕、抗血吸虫、抗弓形虫和抗卡氏肺孢子虫肺炎等作用。不断扩展的适应证意味着需要一个稳定而充足的青蒿素供应。 

现在青蒿素的来源主要有如下四种方式。 

第一种方式是直接从青蒿中提取，这种方式如今仍然是青蒿素的主要来源，但天然青蒿中青蒿素含量很低(0.01％～0.6％，少数能达到1％)。此外，不同基因型青蒿以及青蒿不同组织之间的青蒿素含量差异很大，青蒿虽为雌雄同株，但存在自交不亲和性，因此这种遗传不稳定性是常规栽培中很难克服的难题。人工栽培青蒿还存在受季节和气候条件限制等问题。所以，通过栽培扩大青蒿素的提取量，这种方式不能满足人们对青蒿素日益高涨的需求。 

第二种方式是通过化学全合成来生产青蒿素，但这种方式成本高，难度大，目前还不能投入生产，基本上处于试验阶段。 

第三种方式是通过细胞或愈伤组织来生产青蒿素。中国科学院植物研究所叶和春领导的研究组曾通过培养青蒿发状根获取青蒿素，其青蒿素的含量可达550mg/L(LiuCZ，Wang YC，Ouyang F，Ye HC et al.Production of artemisinin by hairy root cultures ofArtemisia annua L.Biotechnology Letters，1997，19(9)：927-929)，但要进行商业化生产还需要做很多工作。 

第四种方式是通过代谢工程来生产青蒿素，这种方法主要是将青蒿素生物合成基因在微生物中组合表达，在微生物中重新组建青蒿素生物合成途径，利用“微生物工厂”来生产青蒿素。目前多在微生物中重新构建青蒿酸(artemisinic acid)生物合成途径，利用重组菌生产青蒿酸，再以此为起始原料化学半合成青蒿素。 

青蒿素的生物合成途径主要包括三大步骤：由乙酰辅酶A形成法尼基焦磷酸(famesyl pyrophosphate，FPP)，再由FPP合成紫穗槐-4，11-二烯(amorpha-4，11-diene)，由紫穗槐-4，11-二烯形成青蒿酸，进而形成青蒿素。目前基本上认可的青蒿素生物合成途径如下：FPP在紫穗槐-4，11-二烯合酶(amorpha-4，11-diene synthase，ADS)的催化下合成紫穗槐-4，11-二烯；紫穗槐-4，11-二烯通过羟基化形成青蒿醇(artemisinicalcohol)，进而被氧化形成青蒿醛(artemisinic aldehyde)；紧接着，青蒿醛C₁₁-C₁₃位  被还原形成二氢青蒿醛，后者再氧化形成二氢青蒿酸。其中紫穗槐-4，11-二烯氧化形成青蒿醇、进而形成青蒿酸的反应由紫穗槐-4，11-二烯P450羟基化酶(CYP71AV1)(Teoh KH，Polichuk DR，Reed DW，et al，Artemisia annua L.(Asteraceae)trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1，a cytochrome P450 with a key role in thebiosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin FEBS Lett.2006，580(5)：1411-1416)催化。 

申请日为1999年8月27日、授权给吉诺克里普生物技术有限公司的中国专利CN1253573C(专利号ZL 99811714.5)中公开了一种编码紫穗槐-4，11-二烯合酶的DNA序列，并提到可以用该DNA序列转化宿主细胞、组织或生物体，利用其表达的紫穗槐-4，11-二烯合酶催化形成紫穗槐-4，11-二烯，分离所形成的紫穗槐-4，11-二烯并将其转化为青蒿酸。但是在其实施例6中只是公开了在体外将大肠杆菌表达的紫穗槐-4，11-二烯合酶与α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精一起温育来产生青蒿酸的实验步骤，并没有给出具体的实验数据，更没有数据显示在大肠杆菌中实现了青蒿酸的生成。