[发明专利]试样调制法及装置

说明书

技术领域

本发明涉及用于基因分析技术的试样调制法。更详细地讲，涉及用于1个细胞中包含的mRNA的数据分析或同时逐个分析多个标的分子的方法的试样调制法。

背景技术

随着人类基因组序列译解的完成，来到了深入地研究种种基因组的信息并活用它们的时代。基因组信息被mRNA复制，翻译成蛋白质。这样进行的基因的表达轮廓分析，对详细研究生命活动是不可缺少的。到现在为止，成为主流的分析方法是从多个细胞取出mRNA，进行了荧光标识之后让DNA探针阵列(DNA芯片)起作用，在具有与mRNA互补序列的捕获在探针标识mRNA的检测方法。与此相对，也有从多个细胞取出mRNA，制造该cDNA，并对其进行电泳分离而测量的方法。这个方法是模拟地测量种种的mRNA的量的方法，不过，从测量灵敏度问题考虑，必须使用多个细胞取出mRNA进行测量。

另外，生命活动被认为以多个细胞协调构成一个系统而成立，组织中的各个细胞有各自不同的作用。要理解真正的生命，监视这样的各个细胞的作用是重要的，开始重视1个细胞中包含的mRNA或蛋白质的测量。而且把1个细胞中微量包含的mRNA的种类和量进行正确定量分析是必要的。但这样的方法尚没有。

发明者们为了克服这个问题，把通过把1个细胞中包含的全部的mRNA或认为必需测量的多种类的mRNA进行数字计数进行定量分析作为目标。所谓数字计数，是确定各自的mRNA(或cDNA片断)的序列而确定种类，统计具有该序列的mRNA包含几个的定量分析的方法。

即，通过对在细胞这样的小区域中包含的多个mRNA或各DNA片断进行序列分析进行数字计数，不过，为此必须能个别地扩增各个的mRNA(或cDNA片断)进行序列分析。在这里重要的是无遗漏地独立扩增全部的mRNA(或cDNA片断)。

上述的方法，并列一分子的DNA或mRNA作为原材料进行多个PCR扩增，不过，试样以溶液状在其中包含从数十到百万级的mRNA或cDNA片断。当把这些一起进行PCR扩增，在得到多个扩增产物的混合物情况下，不能得到目的测量试样。需要使各个mRNA独立，没有遗漏地扩增，并将它们分别取出。为了独立扩增各个的mRNA，以各自被分离了的状态个别进行PCR反应，不过，为此每一反应体积的反应开始时的DNA或RNA分子数的期望值到成为1以下，必须在进行了稀释划分试样溶液之后，对各个的区划独立进行PCR扩增反应。譬如，估计某试样中的扩增对象分子数为10万分子时，由于把试样溶液稀释划分成数十万以上，通过各自个别进行PCR(polymerase chain reaction)等的扩增反应独立扩增试样中的全部的分子，即能克隆扩增。

用这样的方法个别地扩增多个DNA的试验近几年尝试了几个。譬如在平面板上设置非常多的微小反应孔，使包含靶DNA片断和扩增必要的酶和反应底物等的溶液流到板上，划分成微小反应孔。划分的PCR溶液因为被互相分离，能独立扩增。通过调整为进入1个区划的DNA试样的量成为平均1个以下而能个别地扩增。这个方法的一例，在分析化学中被公开(非专利文献1)。本例，在硅基板上构筑1万个孔实现高集成化。可是，为了扩增100万个DNA片断需要更多个反应孔。另外，不可能把成为对象的试样溶液全部不剩注入微小反应孔，溶液剩余或被反应孔的内壁等吸附，产生了在PCR扩增反应中没有使用的DNA。

另外，不是以来自1个分子的扩增作为目标的尝试，不过，也有不使用微小容量的滴定板而使用平面的凝胶点阵进行PCR的例(专利文献1)。以前，采用在低温进行凝胶化的材料使PCR产物试样溶液凝胶化提高试样的操作性的方法是公知的(专利文献2)，但在该例中，利用矩阵配置了凝胶化试样的基因检验用芯片。可是，由于该方法采用了空间固定的反应孔，所以在反应孔中也存在包含目的扩增产物的东西，不过，也存在完全不包含的东西。为此，出现了没有被扩增的目标试样，怎么区分目的扩增产物成为问题。

进而，作为一个更有力的方法，有被称作为乳剂PCR的方法。该方法代替使用每试样独立的反应容器，在油中形成多个的微小液滴内进行反应。用该方法，由于液滴的微小化通过搅拌等容易进行，所以在100微升左右的一个容器内能形成数十万个以上的相当反应容器的微小液滴。