[发明专利]利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞工程技术领域，更具体涉及一种利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法。

背景技术

天然橡胶为四大工业原料之一，也是极为重要的战略资源。目前，在自然界大约2000余种产胶植物中，商品天然胶约99％来源于巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)。巴西橡胶树属大戟科橡胶树属多年生高大乔木，常规育种周期为30多年，超长的育种周期使巴西橡胶树新品种选育和更新受到了很大的限制。为了拓宽巴西橡胶树的育种途径和创新育种方法，从上个世纪50年代以来，世界各国的育种工作者开始研究生物技术在巴西橡胶树育种中的应用。花药和内珠被的体细胞胚胎发生和胚胎植株再生的成功使巴西橡胶树新型种植材料——自根无性系的利用成为现实可能。巴西橡胶树存在两个不同生理状态的发育阶段——幼态阶段和老态阶段，大田试验已经证明橡胶树幼态无性系比其同源老态无性系在生长和产胶方面都具有明显的优势，可增加干胶产量10～50％，而通过体细胞胚胎发生是目前获得自根幼态无性系的唯一可行方法。自根幼态无性系的大规模工厂化生产和商业化应用，将带来巴西橡胶树种植材料的革新和种苗生产模式的重大改变。

目前，巴西橡胶树自根无性系的生产能力，还只能提供小规模的实验应用，规模化生产受到了巴西橡胶树低效的胚胎发生、低效的植株再生和低效的自根无性系微繁三个方面的限制。巴西橡胶树的胚胎发生主要通过两种途径获得：花药和内珠被培养。其基本过程是：1)剥取单核靠边期花药或幼嫩种子内珠被进行愈伤组织诱导培养，约40-60天；2)将愈伤组织转入体胚发生培养基，进行体细胞胚胎发生诱导，约10-30天；3)经体胚发生诱导后，部分愈伤上会出现球形胚、子叶形胚等胚状体；4)将成熟的子叶形胚转入植株再生培养基上进行植株再生。这种方法需要不断的从大田中采集外植体，受到环境和气候的影响。自根无性系的微繁技术则是将通过上述途径获得的自根无性系的茎干切成几段，每一段都带有一个茎干芽，通过适当条件的培养诱导茎干芽萌发，从而实现无性系扩繁的目的。但，目前报道的结果显示此方法的扩增效率在2-3倍，效率明显偏低，特别是对于胚胎发生能力差的品种。

迄今，巴西橡胶树自根无性系植株在多个国家已经进入大田生产试验，与传统的芽接苗相比，自根无性系植株较芽接苗增产10-50％，这使得自根无性系植株将成为未来橡胶树主要种植材料。然而，目前巴西橡胶树自根无性系植株生产存在主要问题是：1、花药和内珠被的获得受季节的限制，无法持续的、长期的获得外植体；2、胚胎发生能力受到基因型的影响，一种诱导胚胎发生的体系对于一种或几种基因型最有效，不具有普遍通用性；3、目前自根无性系微繁技术扩繁效率低。这些问题严重阻碍了自根幼态无性系的规模化生产，因而无法满足大田生产对大量自根无性系幼态植株的需求。为此，必须建立能大量的、持续的、长期的和可快速扩繁的自根幼态无性系的技术体系，为工厂化生产自根幼态无性系植株寻求解决问题的新技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法，它是利用成熟胚良好的胚胎发生能力，实现由胚到胚的循环增殖的方法，实现了自根幼态无性系大规模扩繁的目的。

本发明所设计的利用胚状体快速繁殖巴西橡胶树自根幼态无性系的方法包括花药胚性愈伤组织诱导过程、初生体细胞胚胎发生过程、次生胚状体的诱导过程和植株再生过程。

1、花药胚性愈伤组织诱导过程是以巴西橡胶树花蕾为外植体，将花蕾进行表面消毒，将消毒好的花蕾中的雄蕊剥出，将其接种到诱导愈伤的诱导愈伤培养基上进行暗培养；所述诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量进行调整，再附加2，4-D、KT、NAA、Phytagel、蔗糖和椰子水。

2、初生胚状体诱导过程是将经过诱导培养的愈伤组织接种到胚胎诱导培养基上进行暗培养，得到胚状体；所述胚胎诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并将MS培养基中的磷酸二氢钾、无水氯化钙、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量进行调整，再附加2，4-D、KT、NAA、Phytagel、蔗糖、活性碳和椰子水。

3、次生胚状体的诱导过程是将得到的胚状体切段，并接种到诱导愈伤培养基上进行暗培养；然后再接种到胚胎诱导培养基上进行暗培养，得到成熟子叶形胚。