[发明专利]一种检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本发明涉及一种用于检测三聚氰胺的直接竞争法酶联免疫试剂盒。

技术背景

三聚氰胺(Melamine)，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末，无味。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂，在部分亚洲国家，它也被用以制造化肥。它是一种禁止用于宠物食品及动物饲料的化学物质，动物食用后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡。

2007年3月中旬以来，美国发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。经调查，是由于一些宠物饲料供应商为了增加饲料中蛋白质的含量，在小麦蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三聚氰胺，从而导致猫、狗中毒死亡。

因此亟需建立方便快捷且灵敏度高的检测方法，禁止此类事件的发生。

现有的三聚氰胺检测方法多为色谱法，但是这些方法需要有完善的实验室，有经验的技术人员，复杂的仪器设备，且检测过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。基于此原理建立的直接竞争法酶联免疫检测技术较间接方法进一步缩短了检测时间。该技术的关键是完全抗原和酶标记抗原的合成及抗体的制备。

目前，三聚氰胺的直接竞争酶联免疫检测方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。

本发明提供了一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括：三聚氰胺特异性抗体酶标板、酶标三聚氰胺。其中三聚氰胺特异性抗体为兔抗三聚氰胺的多克隆抗体，用三聚氰胺与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的酶标记三聚氰胺采用化学方法偶联得到，标记酶为辣根过氧化物酶，所述偶联方法为琥珀酸酐法。

用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。

为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括包被有三聚氰胺特异性抗体的酶标板、三聚氰胺标准溶液、显色剂、洗涤液、终止液、酶标物稀释液和浓缩样品稀释液。

所述的洗涤液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1∶1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液，所述的酶标物稀释液为含0.01％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

另一方面，本发明还提供了一种检测饲料样品中三聚氰胺含量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗体的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入酶标记三聚氰胺，孵育后洗涤拍干，加入显色剂显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；

(3)分析检测结果。

本发明试剂盒的检测原理为：

将三聚氰胺抗体包被于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液并加入酶标记三聚氰胺工作液，待测样品中的三聚氰胺与酶标记三聚氰胺竞争固相化的三聚氰胺抗体，通过洗涤出去未结合的酶标记物，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中三聚氰胺的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出三聚氰胺浓度范围。

有益效果：

本发明检测三聚氰胺的试剂盒主要采用直接竞争酶联免疫测定法定性或定量检测样品中三聚氰胺含量；进一步缩短了检测时间，有间接竞争法的2个小时缩短为1个小时，对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

本发明该试剂盒采用高特异性的三聚氰胺多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为三聚氰胺抑制曲线。

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

             实施例1三聚氰胺免疫原的合成及免疫血清的制备

1.1试剂与仪器