[发明专利]一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法

说明书

技术领域：

本发明涉及乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus HBV)基因及其变异的分子检测方法。尤其是HBV基因组包括DNA和RNA以及YMDD基因变异的多聚酶链反应(Polymerase ChainReaction)PCR扩增检测法和检测试剂盒。 

背景技术：

乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的传染病，据世界卫生组织报导，全球约20亿人曾感染过HBV，其中超过了3.5亿人为慢性乙肝病毒HBV感染者，我国是乙肝感染高流行区。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科，也是慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭及原发性肝细胞癌的主要原因。乙肝感染的诊断目前主要依据血清学酶免方法检测，随着PCR技术出现而发展了许多HBV基因扩增PCR检测法，然而PCR太过灵敏容易带来假阳性问题。乙肝感染的控制主要采用乙型肝炎疫苗接种预防，乙肝的治疗采用α-干扰素和核苷酸类抗病毒药拉米夫定(Lamivudine)。然而拉米夫定治疗中受药物选择而容易产生耐药变异株。据临床统计，血清e抗原阳性病人经一年拉米夫定治疗，会有14-32％耐药，长期治疗，第二、三、四年的耐药率增加至38％、49％和66％(Karayianmis P.，Journal of Antimicrobial Chemotherapy2003，51：p761-785)。耐药株基因变异主要在HBV多聚酶活性区PoL/RT片段(349-692 aa，即rt1-rt344)，常见的是酪氨酸-蛋氨酸-天门冬氨酸-天门冬氨酸YMDD变异，即由YMDD变异为YIDD(rtM204I/aaM552I)或YVDD(rtM204V/aaM552V)，YVDD常伴有rtL180M变异(Lai CL.，et.al.，Clin.Infect.Dis，2003，36：p687-696)。而且血清HBV RNA的YMDD变异更早于HBV DNA变异检测(Hatakeyama.，et.al.，Hepatology；2007，45-5：p1179-86)。因此，检测HBV YMDD基因变异尤其RNA的YMDD变异对调整治疗用药、及时用阿德福韦(adefovir)代替拉米夫定的耐药无效治疗具有重要的指导意义。 

目前对HBV YMDD变异株的检测方法多采用PCR或RT-PCR扩增HBV多聚酶P基因产物测序法(Chayamak，et.al.，Hepatology 1998，27：p1711-1716)；PCR-RFLP限制性片段长度多态性分析法(Allen MI.，et al.，Journal of Clinical Microbiology 1999，37-10：p3338-3347和中国专利200710036511.9)；各种荧光PCR分析法(Whallyey SA，et al.，J Clinical Microbiol，2001，39：p1456-1459；Wang PZ，et al.，World Clin J Digestol 2004，12-3：p600-603和中国专利200510065445.9)；以及线性探针反向杂交法INNO-LipA(Osinwg C.，et al.，Journal of ClinicalMicroliology 2003，41-72：p5473-5477)。这些基于传统PCR技术的应用方法不仅存在着繁琐、费时，不便于临床快速监测，最重要的是PCR技术太过于灵敏，极易产生假阳性扩增。

基因芯片技术是近十年来发展起来的高效大规模并行分析技术，广泛应用于生物学许多领域。并且在HBV拉米夫定抗药性检测中得到应用(Jang H.，et.a1.，Journal of ClinicalMicrobiology，2004，42-9：p4181-4188；中国专利：03111452.0和02221161.6等)。然而这种固相生物芯片加工繁琐昂贵，分子在固相表面较液相中反应不均一，不充分，芯片之间的加工差异而导致重复性不好。需要专用复杂仪器，不便于推广等。我国HBV慢性感染者众多，在拉米夫定治疗中亟待发展更有效，简便，快捷的耐药YMDD变异检测方法，以建立完善的耐药监测体系以指导临床合理用药。 

发明内容：

针对上述领域中的缺陷，提供一种检测乙型肝炎病毒P基因YMDD变异的置换扩增法，通过置换法降低扩增灵敏度来规避PCR产物再污染导致的假阳性问题，同时给合荧光显色，可检测各变异株的含量。