[发明专利]毕赤酵母基因工程菌株及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种毕赤酵母基因工程菌株及其该菌株在生产木质素过氧化物酶中的用途。

背景技术

木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase，简称LiP)是一种来源于真菌的过氧化物酶，是降解木质素过氧化物酶系的主要成分。它是由一系列含有血红素辅基的同功酶组成的，分子量在38～43kD之间，其主要成分为LiPH2。此酶能直接降解植物原料中的木质素，对自然界木材腐朽及制浆造纸脱木素意义重大。

目前，木质素过氧化物酶的生产主要采用白腐真菌。但白腐真菌只有在限氮或其它不均衡的培养基中才能分泌木质素过氧化物酶，且培养基成分十分复杂。白腐真菌的经典培养基为Kirk培养基(Kirk TK.，Schultz E.，Connors WJ，Lorenz LF.and Zeikus JG.，Influence of culture parameters onlignin metabolism by phanerochaete chrysosporium，Arch.Microbiol.117(1978)277-285)，包括以下成分：

(1)基本培养基(每升)：KH₂PO₄ 4.1mmol，MgSO₄ 6.09mmol，CaCl₂0.55mmol，1ml无机溶液，0.5ml维生素溶液，其中，无机溶液成分为(每升)：氨基酸7.8×10^-3mol，MgSO₄ 1.2×10^-2mol，MnSO₄ 2.9×10^-3mol，NaCl1.7×10^-2mol，FeSO₄ 3.59×10^-4mol，CoCl₂ 7.75×10^-4mol，CaCl₂ 9.0×10^-4mol，ZnSO₄ 3.48×10^-4mol，CuSO₄ 4×10^-5mol，AlK(SO₄)₂ 2.1×10^-5mol，H₃BO₃ 1.6×10^-4mol和Na₂MoO₄ 4.1×10^-5mol；维生素溶液成分为(每升)：2mg生物素，2mg叶酸，5mg盐酸硫胺素，5mg核黄素，10mg维生素B₆盐酸盐，0.1mg维生素B₁₂，5mg烟酸，5mgDL-泛酸钙，5mg对氨基苯甲酸，5mg硫辛酸；

(2)氮源：1.2mmol/L酒石酸铵

(3)碳源：1％(质量浓度)葡萄糖(56mmol/L)

(4)缓冲成分：20mmol/L的DMS

(5)pH：4.5

另外，通过培养白腐真菌生产LiP的周期较长，一般讲，LiP的合成开始于第3-4天，而在第6-7天达到高峰(李慧蓉，白腐真菌生物学和生物技术，化学工业出版社，2005年)。

综上所述，利用白腐真菌来生产LiP，由于培养基成分复杂，生产周期长，造成了实际应用中的困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种毕赤酵母基因工程菌株。

本发明的另一个目的是提供该菌株在生产木质素过氧化物酶LiPH2中的用途。

毕赤酵母基因工程菌株(Pichia pastoris)WX-33-LiPH2是由毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33野生菌株作为宿主菌，通过分子生物学方法将LiPH2基因整合到其染色体上，从而得到的一株基因工程菌。此菌株能够快速生长并且在甲醇诱导下分泌出具有活性的LiP蛋白。

本发明的具体制备方法如下：

1、诱导培养白腐真菌Phanerochaete chrysosporium BKM-F-1767菌株(参见文献李越中，高培基，王祖农.黄孢原毛平革菌合成木素过氧化物酶的营养调控.微生物学报，1994，34：29-36)；

2、提取菌株的总RNA，然后采用一步法反转录获得高活性木质素过氧化物酶基因LiPH2；

3、用pUCm-T载体构建LiPH2基因片段的克隆载体，保存至大肠杆菌DH5α中；