[发明专利]检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其酶联免疫试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度传染性、高致病性和高致死性的烈性动物疫病，对养猪业危害巨大，是世界动物卫生组织确定的法定报告的烈性传染病之一，也是我国确定的一类动物疫病之一。一直以来，我国对于猪瘟疫情所采取的措施是“防制”。防，就是通过免疫的方式，用减毒活疫苗(猪瘟兔化弱毒疫苗)进行预防接种；制，就是对疫情进行控制，进行监测、隔离，甚至是局部的“扑杀”。在猪瘟的防制工作中，监测和检测猪血清中猪瘟病毒特异性抗体的水平是非常重要的一个环节。对于尚未接种的猪只，血清中的猪瘟病毒特异性抗体既可能反映了母源抗体的影响，也可能反映了隐性感染的迹象。母源抗体含量在一定水平之上和隐性感染的存在都会影响到减毒活疫苗接种的效果，甚至可能使疫苗无效，无法产生对病毒的免疫防护，导致免疫失败。对于已经接种的猪只，血清中的猪瘟病毒特异性抗体的水平则反映了免疫的效果。

由于猪瘟病毒和同属的牛病毒性腹泻病毒以及羊边界病毒，在抗原结构上有共同抗原决定簇，因此，由这三种病毒制备的抗血清具有较强的交叉反应；牛病毒性腹泻病毒和羊边界病毒也可以感染猪只。另一方面，猪瘟病毒的各个毒株虽然同属于一个血清型，但在毒力、致病性和抗原性等生物学特性上存在着复杂性、多样性和可变性，国内外制备的猪瘟病毒特异性单克隆抗体中，能广泛识别多个毒株的，屈指可数。猪瘟病毒的血清学诊断是一项极为重要而细致的工作，既需要对毒种有“特异”的鉴别诊断作用，又需要能广泛识别猪瘟病毒的不同毒株的广谱作用。在诊断方法和诊断试剂的生产工艺上，还需要快速、简便、实用和降低生产成本，以适应于田间大规模推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其专用酶联免疫试剂盒。

本发明所提供的检测猪瘟病毒特异性抗体的酶联免疫试剂盒，包括猪瘟病毒抗原多肽和酶标猪瘟病毒特异性抗体；所述猪瘟病毒抗原为含有一个或一个以上的序列1所述氨基酸残基序列的多肽。

所述试剂盒还包括酶标板、阳性血清对照、阴性血清对照、显色剂、洗涤液、终止液。

所述酶标猪瘟病毒特异性抗体为辣根过氧化酶标记猪瘟病毒特异性抗体；所述猪瘟病毒特异性抗体是以猪瘟病毒为免疫原得到的多克隆抗体，用偶联有上述猪瘟病毒抗原的免疫亲和层析柱经层析纯化后得到的针对具有序列1所述的氨基酸残基序列的猪瘟病毒表位抗原的猪瘟病毒特异性抗体。

所述猪瘟病毒优选为猪瘟病毒兔化弱毒。

所述猪瘟病毒抗原多肽是以PBS为溶剂的猪瘟病毒抗原溶液，在包被酶标板时用0.1M，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；所述酶标猪瘟病毒特异性抗体是以PBS为溶剂的酶标猪瘟病毒特异性抗体溶液。

所述阳性血清对照为猪瘟病毒兔高免血清；所述阴性血清对照为未感染过猪瘟病毒的健康兔血清。

所述洗涤液为含有体积百分含量为0.05％的Tween-20的PBS缓冲液；所述终止液为2mol/L硫酸溶液；所述封闭液为含有质量百分含量为0.25％的明胶的PBS溶液。

所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为含有1mg/ml OPDpH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，显色液B为过氧化氢。

本发明所提供的检测猪瘟病毒特异性抗体的方法，是利用上述的酶联免疫试剂盒，用固相抗原竞争酶联免疫法(又称“阻断法”)检测猪瘟病毒特异性抗体。

本发明的猪瘟病毒特异性抗体的检测试剂，主要成分是针对猪瘟病毒结构蛋白E2上一个高度保守表位(TAVSPTTLR)的特异性抗体和含有该表位的抗原多肽。实验证明利用表位合成肽作为抗原包被，并配以酶标TAVSPTTLR表位特异性的血清抗体(从兔高免血清中纯化)，可以通过固相抗原竞争酶联免疫法(阻断法)对猪瘟病毒特异性抗体进行有效的检测；猪瘟病毒毒种特有的该B细胞表位保证了鉴别诊断，而该表位在各毒株间的高度保守性又保证了检测的特异性。

附图说明

图1为抗原在工作浓度的确定结果

图2为本发明的试剂盒对含有猪瘟病毒抗体的猪血清进行检测的结果

具体实施方式

下述实施例的方法，如无特别说明，均为常规方法；

下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、检测猪瘟病毒特异性抗体的酶联免疫试剂盒的制备

本发明的检测猪瘟病毒特异性抗体的酶联免疫试剂盒，包括下述试剂：

1)酶标猪瘟病毒单表位特异性的抗体工作液；