[发明专利]无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生产植物甾醇酯的方法。

背景技术

植物甾醇是一种具有生理功能的天然产物。许多文献报道甾醇起到预防心血管疾病的作用，因为它能有效降低有害低密度胆固醇(LDL)的水平，但游离甾醇在水和油中的溶解度小限制了它的应用，植物甾醇在应用中存在以下问题：1)结晶形式使其在人体内的溶解性和生物可利用性比较差；2)不溶于水，在油中的溶解度也很小，给应用于食品工业带来困难。由于植物甾醇酯具有良好的脂溶性，所以将植物甾醇与脂肪酸酯化后转化成油溶性的植物甾醇酯，能够解决在食品工业中应用的限制。另外由于油酸等脂肪酸本身就具有很好的生理功能，所以脂肪酸的甾醇酯则可兼具两者的功效，降低血清胆固醇和甘油三酯效果更佳，能更好地发挥植物甾醇的生理功能。

目前植物甾醇酯一般采用化学法合成和酶法催化合成两种方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制作工序简单、成本低的无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)固定化全细胞酶的制备：

(1)将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)按常规方法配制成10²～10⁴孢子悬浮液，得葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，备用；

(2)摇瓶培养基配制：按各组份所占质量百分比：全脂豆粉2.0％，菜籽油0.3～0.6％，磷酸氢二钾1.2％，硫酸铵0.3％，硫酸镁0.3％，磷酸二氢钠0.4％，水95.2～95.5％；选取全脂豆粉、菜籽油、磷酸氢二钾、硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钠和水混合，得摇瓶培养基，备用；

(3)将聚氨酯剪切成3～5mm泡沫颗粒，备用；

(4)按100ml摇瓶培养基中加1～3ml葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)孢子悬浮液，100ml摇瓶培养基中加聚氨酯泡沫颗粒0.3～0.5g，将葡枝根霉(Rhizopus stolonifer)和聚氨酯在摇瓶培养基中，26～30℃条件下培养40～60h；取出长满葡枝根霉(Rhizopusstolonifer)的聚氨酯泡沫颗粒，真空干燥，得固定化全细胞酶，备用；

2)酯化：将油酸、月见草油或食用大豆油中加入甾醇和固定化全细胞酶，加塞后置于水浴恒温振荡器中在温度40～60℃、转速100～300r/min的条件下进行酯化反应，反应时间46～50h，得酯化后的反应产物；其中，油酸、月见草油或食用大豆油与甾醇的质量比为3～7∶1；固定化全细胞酶为下述：(1)油酸、月见草油或食用大豆油，(2)甾醇，二种质量之和的1.0～1.7％；

3)离心分离、干燥：将酯化后的反应产物离心分离，离心后的上层液为植物甾醇酯产品；离心后的固体物冷冻干燥，得固定化全细胞酶，可重复使用。

步骤3)所述的离心分离的条件是：2000～4000rpm，离心10～20min。

步骤3)所述的冷冻干燥的条件是：-10～0℃，1mbar，干燥时间3～5小时。

本发明与化学合成法相比，无溶剂全细胞酶催化合成有2个优点：1)反应选择性高，反应过程中副产物少；2)反应条件温和，整个生产过程在常温下进行，可以有效避免多元不饱和脂肪酸的氧化。本发明与有机相脂肪酶合成法相比，无溶剂全细胞酶催化合成有2个优点：1)采用全细胞，免除了脂肪酶的分离、提取、纯化和固定化等复杂工序，是克服目前脂肪酶生产、应用成本高的有效途径之一；2)无溶剂体系可以在生产过程中，不需要任何有机溶剂。这不仅可以在生产工艺中免除了有机溶剂脱除，是一种绿色环保的工艺路线。有利于今后的产品开发；而且不会产生不利于消费者身体健康的残余有机溶剂。

产生脂肪酶的生物全细胞作为催化剂(简称固定化全细胞酶)，即将产脂肪酶的微生物细胞固定在聚氨酯泡沫颗粒中，进行发酵培养后，收集聚氨酯泡沫颗粒，经过简单处理后即可作为一种生物催化剂，催化脂肪酸、油脂和植物甾醇转化生成植物甾醇酯。

本发明的有益效果是：

1)制作简单：本发明制作工序简单，不需要复杂设备；将供试菌株进行发酵培养后，收集固定菌体进行干燥。

2)降低成本：以固定化全细胞酶催化剂的形式利用脂肪酶，既省去了脂肪酶的分离提取、纯化和固定等工序，也避免在此过程中的酶损失，节省了大量设备投资、运行费用，适用于工业化生产。