[发明专利]苎麻高效遗传转化的方法

说明书

技术领域

本发明属于新植物和植物基因工程技术领域。具体涉及一种苎麻高效遗传转化方法及应用。

背景技术

经过20多年的研究，人们已经建立了多种植物遗传转化体系(方法)，一般可以分为以下三类：(1)DNA直接导入法。包括化学诱导DNA直接转化(PEG介导法、脂质体介导法)和物理法诱导DNA直接转化(电激法、超声波介导、显微注射、激光微束介导、基因枪法介导)。(2)种质系统介导基因转化(germ line transformation)。包括花粉管通道法、生殖细胞浸泡法、胚囊、子房注射法。(3)载体介导基因转化。包括农杆菌介导法(根癌农杆菌Ti质粒和发根农杆菌Ri质粒介导)和植物病毒载体介导法(DNA病毒转化载体介导和RNA病毒转化载体介导)(王关林和方宏筠，2002；闫新莆，2003)。在以上所有的转基因方法中，研究最清楚和应用最成功的是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化，自1983年人们第一次用这种方法获得转基因植物开始，在已获得的近200种转基因植物中约80％是用这种方法完成的(王关林和方宏筠，2002)。

苎麻(Boehmeria nivea L.)为荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Bochmeria)多年生韧皮纤维作物，起源于我国，被西方人称为“中国草”。在我国有着悠久的栽培和加工历史，很早就在欧美和东南亚国家得到广泛利用，有“纤维之王”和“纤维至宝”的美称。苎麻作为我国重要的纺织工业原料作物，其纤维品质优良，在纺织上有重要地位，越来越多地引起政府和科技工作者的重视。

然而苎麻的遗传转化研究起步较晚，国内外的报道不多。在国内，陈德富等(1996)分别用根癌农杆菌C₅₈₅₁(pBz6111)和发根农杆菌A₄与苎麻试管苗上三叶共培养48小时，经过C₅₈₅₁介导的叶片叶脉处在转入含25mg/L卡那霉素的选择培养基中12天时，产生肉眼可见的愈伤组织；发根农杆菌A₄转化的叶片在第21天时虽然无愈伤组织产生，但有少量根产生。而在与这两者相同的时间里，对照材料(没有与农杆菌共培养的叶片)既没有产生愈伤组织，也不发生不定根，且叶片黄化死亡明显。直到最近，苎麻遗传转化研究才取得了进一步的进展。蒋建雄(2000)以根癌农杆菌AGL1、EHA105、LBA4404对外植体进行敏感程度比较，结果EHA105对外植体的浸染能力最强，最后采用EHA105作为转化菌株，获得抗除草剂“basta”的转基因植株。而后，陈建荣等(2005a)构建了CCoAOMT基因反义表达载体，用农杆菌介导法进行了苎麻遗传转化研究，获得了转基因植株并进行了PCR检测。同年，陈建荣等(2005b)报道用农杆菌LBA4404(pBI121-antiBNCCoAOMT)侵染苎麻试管苗叶片，研究了不同的外植体预培养时间、农杆菌悬浮培养基、培养温度、农杆菌生长程度、侵染液配制浓度、浸泡的时间、洗菌溶液和抑菌抗生素的种类、浓度等多方面的影响，并获得了卡那霉素抗性植株(没有作进一步的分子检测)。而易自力等(2006)以“湘苎2号”下胚轴为受体，利用农杆菌介导法进行了苎麻转Bt基因研究，获得了一批转抗虫基因植株，并通过点杂交分析和PCR-Southern杂交分析证实了抗性植株为阳性。除了农杆菌介导的遗传转化外，张福泉等(2000)用超干胚浸渍法将棉花DNA导入苎麻种子，在D1代，发现了在叶片的缺刻、茸毛上存在差异的变异株；而在D2代，则发现了在株高上有明显不同的植株。经过RAPD验证，发现有的变异株中出现了棉花的特异带，有的则出现受体和供体均没有的新带，还有的出现了受体DNA带在变异株中消失的情况。

在国外，巴西人Dusi等(1993)利用子叶在RR培养基(B5+0.2mg/L IAA+2.0mg/L6-BA)中培养，获得了再生植株。然后利用根癌农杆菌EHA101菌株(pGV1040)侵染再生植株的叶片，将一个和蛋白质有关的基因导入苎麻基因组。经过选择培养等流程，获得了再生植株，经过GUS检测和Southern杂交检测证实已将该基因成功导入了苎麻基因组。