[发明专利]人中期因子Midkine的制备及新用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及人中期因子的制备及其新用途。

背景技术

中期因子(Midkine，简称MK)是一种肝素结合性生长分化因子。它在很多生物过程中均有参与，如神经细胞的存活和分化、肿瘤发生及组织重建。Midkine在胚胎期广泛分布，在妊娠中期表达量最高，随着胚胎的发育和成熟，其表达量逐渐降低。Midkine在正常的成体组织中表达量极低且非常局限，仅在肾脏、胃和小肠中有少量表达。此外，在肿瘤和一些再生组织中Midkine的表达量会明显升高。

MK的受体是一个分子复合体，既包括跨膜蛋白，又包括跨膜蛋白多糖。迄今为止，已经确定的MK受体有受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPζ)、变性淋巴瘤激酶(ALK)以及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)。此外，一个跨膜的肝素硫酸盐蛋白多糖家族即多配体蛋白聚糖(Syndecans)也作为MK的受体，参与MK相关的信号途径。近来还有报道发现整合蛋白(Integrins)以及神经多糖C(Neuroglycan C)也是MK受体中的新成员。

MK具有较广泛的生理学作用，尤其在促进神经元的生长、发育、分化与成熟，维持神经元的存活及促进神经损伤后的修复与再生方面发挥着重要的作用。近年研究发现，除具有神经营养作用外，MK还表现有一系列与肿瘤的发生和发展密切相关的生物学功能，它在多种肿瘤组织，包括一些癌前病变肿瘤组织中高度表达，并与肿瘤分化程度相关，因此引起人们极大关注。除此之外，MK还与炎症反应密切相关，它可以促进炎性白细胞的迁移。而且，MK还具有抗细胞凋亡的作用，并且在软骨生成以及肝脏再生等再生过程中均有MK的参与。

目前已有的文献报道来看，尽管已经有利用原核系统表达纯化重组人MK蛋白的相关报道。但他们的纯化过程都是用的肝素亲和层析，且对纯化出来的蛋白的纯度和产量都没有很好的描述，质量不高，活性欠佳。而且，以往因为MK在正常成体内几乎不表达，故MK基因一般都是从胎儿肾脏中扩增获得，扩增模板的获得也较为困难。

综上，由于MK具有良好的应用价值，因此迫切的需要一种简便易行且成本低廉的方法，来获得大量的MK重组蛋白；并且，还需要对其进行进一步的功能研究。

发明内容

本发明的目的在于提供中期因子(Midkine)蛋白或其编码基因的新用途。

本发明的目的还在于提供一种制备和纯化中期因子蛋白的方法。

在本发明的第一方面，提供中期因子(Midkine)蛋白或其编码基因的用途，用于制备增加血小板的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物用于防治血小板减少相关疾病。

在另一优选例中，所述的血小板减少相关疾病选自：多发性瘀斑、粘膜出血、术后大出血。

在另一优选例中，所述的中期因子是人中期因子。

在本发明的第二方面，提供一种制备和纯化中期因子蛋白的方法，所述方法包括：

(1)利用含有重组表达载体的重组大肠杆菌表达中期因子，获得中期因子表达产物；

其中，所述的重组表达载体中含有中期因子表达盒，所述的中期因子表达盒中含有中期因子编码基因；

(2)利用强阳离子交换层析从步骤(1)获得的表达产物中分离出中期因子蛋白。

在另一优选例中，所述的表达盒含有与启动子操作性相连的中期因子基因。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的获得中期因子表达产物步骤包括：

(a)培养所述的重组大肠杆菌使之表达中期因子，裂解菌体，收集含中期因子包涵体蛋白的裂解产物；

(b)将步骤(a)获得的含中期因子包涵体蛋白的裂解产物进行蛋白变性和复性处理，从而获得可溶性的中期因子表达产物。

在另一优选例中，采用超声破菌和溶菌酶处理双重方法来裂解菌体。

在另一优选例中，所述的蛋白变性采用盐酸胍作为变性剂。

在另一优选例中，所述的盐酸胍的浓度是6±2M；更优选的是6±1M。

在另一优选例中，所述的强阳离子交换层析采用：强阳离子交换凝胶SPSepharose FF作为层析介质。

在另一优选例中，所述的中期因子蛋白纯度大于99％。

在另一优选例中，所述的中期因子蛋白得率大于9mg/400ml菌液。

在另一优选例中，所述的中期因子蛋白中内毒素含量低于0.2EU/ug。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明