[发明专利]检测奶制品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因芯片和检测用试剂盒，尤其涉及检测奶制品中常见致病菌的基因芯片和试剂盒

背景技术

自2004年4月安徽阜阳发生“劣质奶粉”事件以来，奶粉安全问题成为社会各界广泛关注的焦点。奶粉的主要消费群体是婴幼儿、儿童、老人或病人等免疫力较低的人群，尤其婴幼儿是奶粉的重要消费群体，因此，奶粉的安全性尤为重要，一直受到国务院、职能部门和各级政府的高度重视。2002年科技部下达了“十五”国家重大科技奶业专项，对乳制品中几种常见致病菌进行了快速检测方法的研究。由此可见，研究并建立快速准确检测奶粉及奶制品中的致病菌的方法以保障奶制品的安全非常必要。

根据中国国标和国家质检总局行标的有关规定，目前检验检疫部门对奶粉检测的致病菌项目为：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌和阪崎肠杆菌。此外本发明又增加了近年来引起关注的肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌。因此本发明检测的奶粉及奶制品中常见的十种病原菌为：沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、阪崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌、弗氏柠檬酸杆菌和蜡样芽胞杆菌。

国标中检测致病菌的方法多是采用传统的分离培养和生化鉴定的方法，报告检验结果大致需5～7天，加之检验方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足食品安全和日益发展的国际贸易的需要。在质检部门内部，采用传统方法检测沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌，采用行业标准用PCR的方法检测奶粉中的阪崎肠杆菌，但国标和行标中均没有检测肺炎克雷伯氏菌的方法。

1997年7月，Affymetrics，Inc.(Santa Clara，CA)公司的Thomas R.等人发明的第6,228,575号美国专利公开了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的核酸分析检测技术建立起来，并随着人类基因组计划的开展而逐步发展。该技术综合运用了分子生物学、集成电路制造、计算机、半导体、共聚焦激光扫描、荧光标记等技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌的鉴定，不仅可以大大简化检测手段，提高检测速度，而且具有高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等诸多优点。

目前最常使用的微生物鉴定的靶分子是16S rRNA和23S rRNA，国内外已有很多文献报道。利用16S rRNA和23S rRNA可将细菌微生物鉴定至种或属，但是对于亲缘关系较近的细菌种或属的鉴定十分困难(BodrossyL，Sessitsch A.2004.Oligonucleotide microarrays in microbial diagnostics.Current Opinion in Microbiology 7：245-25)。目前利用16S-23S rRNA间区作为靶分子进行细菌的鉴定已经逐渐成为研究的热点(Nubel U.SchmidtPM，Reiβ E，et a1.2004.Oligonucleotide microarray for identification ofBacillus anthracis based on intergenic transcribed spacers in ribosomal DNA.FEMS Microbiology Letters 240：215-223.)，它的变异速率相当于16SrRNA或者23S rRNA的十倍，因此具有更高的分辨率，甚至可将细菌区分到型，对于亲缘关系较近的种属的区分具有16S rRNA和23S rRNA不可比拟的优势。同时两端是保守的16S rRNA基因和23S rRNA基因区，可在两端的保守区设计通用引物可避免了多对引物带来的引物二聚体的问题，长度在200bp-1000bp之间，大小易于操作，因而靶序列的扩增和标记过程更加简化，也更容易控制，符合操作简便快捷的实际要求。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测奶制品中致病菌的基因芯片，以弥补传统检测奶粉及奶制品中常见致病菌检测技术存在的费时耗力的缺陷，扩展病原菌检测范围，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。