[发明专利]鳞翅目转座子基因tpa及其应用

说明书

技术领域

本发明属于昆虫基因工程领域，具体的说涉及鳞翅目害虫转座子(transposase，tpa)基因片段分离，还涉及tpa基因在鳞翅目害虫抗药性检测中的应用。

背景技术

鳞翅目害虫危害后常造成茶叶减产和品质下降，因此它们是主要茶园虫害防治对象，而拟除虫菊酯类是普遍应用于防治鳞翅目害虫的农药种类。但是由于多年连续使用，鳞翅目害虫对拟除虫菊酯类农药耐受性越来越强，部分甚至出现了抗药性。害虫的农药抗性评价指标尚不明确，害虫抗药性遗传机制也有待研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鳞翅目转座子基因片段tpa，该基因片段tpa可用于评价和测定鳞翅目害虫对农药的抗药性。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种鳞翅目转座子基因片段tpa，其具有SEQ IDNo：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述基因片段tpa的用途，用于评价和测定鳞翅目害虫对农药的抗药性。

作为本发明的基因片段tpa的用途的改进：农药为拟除虫菊酯类农药。

本发明主要针对生产中鳞翅目茶树害虫的抗药性问题，通过分子生物学手段分析鳞翅目害虫抗药性原因，并提出鳞翅目害虫抗药性程度检测新技术。本发明是采用cDNA-AFLP技术分离与鳞翅目害虫对拟除虫菊酯类抗药性有关的基因；并提供了鳞翅目害虫基因转移有关的转座酶tps 3’端基因序列，具体如SEQ ID No：1所示。本发明还提供了该基因在具有不同抗药性的茶树鳞翅目中的表达，证明该基因表达对鳞翅目抗药性表现有非常重要的影响，该基因可能通过其转座行为影响其下游结构基因活性，从而影响害虫的抗药性。实现本发明的具体技术步骤如下：

一、茶树鳞翅目害虫tap基因片段分离和分析

取对拟除虫菊酯有不同抗性的茶尺蠖幼虫各若干头，适当稀释后进行喷雾。0.2-6小时之内，在不同抗药性群体中各选取2-3头幼虫。上述幼虫样品分别置于不同研钵中液氮研磨，以TRIZOL(Invitrogen公司)试剂提取总RNA，并以UNIQ-10柱式mRNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)分离mRNA。分别取1-5μg mRNA进行cDNA合成，双链cDNA合成采用TakaRa MMLV RTase cDNA Synthesis Kit(宝生物工程[大连]有限公司)进行。双链cDNA经异丙醇沉淀纯化后，以TakaRa BamHI/Hha I(宝生物工程[大连]有限公司)组合酶切消化。消化后的片段与事先设计的2个接头SEQ ID No：2和SEQ IDNo：3，以T4 DNA连接酶(上海生工生物工程有限公司)连接。以连接完成的cDNA片段为模板，以预扩增引物SEQ ID No：4和SEQ ID No：5进行PCR预扩增，PCR程序如表第1列所示，将预扩增产物适当稀释后，以选择性扩增引物组合SEQ ID No：6和SEQ IDNo：7，以及SEQ ID No：8和SEQ ID No：9，分别进行PCR选择性扩增，PCR程序如表第2列所示。扩增产物以6％变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析，以核酸银染试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行显带。

表1