[发明专利]用于细胞培养的经细胞外基质包被的表面

说明书

对相关申请的交叉引用

[0001]本申请要求2006年5月16日提交的美国临时申请第60/747,349号、2006年6月30日提交的美国临时申请第60/817,942号、2006年6月30日提交的美国临时申请第60/817,736号、2007年1月2日提交的美国临时申请第60/883,083号和2007年1月29日提交的美国临时申请第60/886,984号的利益，上述申请的内容全部引入此处作为参考。

技术领域

[0002]本发明一般涉及细胞培养领域，更具体而言，本发明涉及一种适合培养胚胎干细胞的细胞外基质组合物包被的基底(substrate)。

背景技术

[0003]胚胎干细胞的特征是具有高端粒末端转移酶活性、无限自我更新能力和多潜能(分化成三个胚层，即，外胚层、内胚层和中胚层，中的任何细胞类型的能力)的细胞。因此，对于人胚胎干(hES)细胞在基因/细胞治疗和再生医药领域的潜在应用，存在极大的希望。

[0004]人胚胎干(hES)细胞的首例成功衍生见Thomson，J.A.等的报道(Science(1998)282：1145-1147)。在那项研究中，hES细胞从胚泡内细胞团分离出来，接种在有丝分裂灭活的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上。最初的hES细胞衍生和培养起源于在过去的25年中主要针对鼠ES(mES)细胞研发的培养实践。虽然MEF饲养层被证明是一种对于hES细胞长期培养很有效的表面，但是这种方法有些局限性。首先，存在对可能转移到hES细胞的潜在动物病原体的担心，这使得它们不适合临床应用。第二，生长和维持两种细胞类型既不方便又很繁重。而且，在饲养层上转染和遗传操作致密的hES细胞集落是很困难的。基于所有这些原因，已经开始为培养hES细胞尝试发展无饲养层的条件。

[0005]小鼠ES细胞研究已经为我们进一步理解hES细胞的自我更新调节机制奠定了基础。对特定的信号调节物的操作促进了未分化hES细胞增殖所需要的无饲养层条件的开发。最近的研究清楚地描绘出hES细胞能在没有饲养层的条件下生长，只要将它们种在适宜的细胞外基质(ECM)上，并且在于饲养细胞上得到的条件培养基中或在补充可溶因子的培养基中培养即可。

[0006]细胞外基质(ECM)是一种组成多变的三维分子复合物，可以包括诸如层粘连蛋白、纤连蛋白、胶原蛋白和其他糖蛋白、透明质酸、蛋白聚糖和弹性蛋白等成分。市售的细胞外基质的例子包括，例如Sigma-Aldrich的ECM凝胶或Becton，Dickinson & Company的Matrigel^TM基质。Matrigel^TM基质是一种从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肿瘤上分离的重建的基底膜。Matrigel^TM基质主要是由层粘连蛋白、胶原蛋白IV、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖组成的。Matrigel^TM基质也包含大量的生长因子，例如EGF、IGF-1、PDGF、TGF-β、VEGF和bFGF。

[0007]本发明以前，众所周知的是在ECM表面上使用来自不同类型的饲养细胞的条件培养基，hES细胞可以在未分化状态增殖。使用ECM作为无饲养层基底培养hES细胞有许多优点。例如，在ECM表面分离DNA、RNA和蛋白由于没有来自饲养细胞的潜在污染而更加容易。此外，hES细胞的遗传操作需要有效的转染能力。生长在Matrigel表面的hES细胞的转染效率相比较生长在饲养细胞上的要高。当在BD Matrigel^TM基质上培养时，早已证明hES细胞形成″单层样″集落，这使得细胞个体更易接近以被DNA或SiRNA渗透。虽然其他ECM蛋白也成功地用于无饲养细胞培养，几项先前的研究表明，为了和Matrigel^TM具有一样好的性能，需要ECM蛋白的组合。此外，纯化蛋白一般更加昂贵，不能象Matrigel^TM那样作长期性能检测。