[发明专利]一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法

说明书

技术领域：本发明涉及降解毒性有机污染物的微生物的筛选与培养方法，特别是一株对河道底泥中硝基苯化合物具有特异降解能力的微球菌(Micrococcussp.)的筛选和培养方法。

背景技术：硝基苯类化合物是美国国家环保总署(EPA)优先控制污染物名录中的典型物质，对人体具有显著的神经和消化毒性，虽然硝基苯在生物体内一般不会累积，但一些研究结果表明：在硝基苯浓度较高的场合，通过食物链摄入，可能会导致诱发恶性肿瘤。因此，采用各种方法严格限制环境介质中的硝基苯含量，对保证人类健康具有重要意义。

硝基苯类化合物通常具有一定的挥发性，一般由化工、炸药、制药等行业产生，并随废水排放至地表水体，如河流。硝基苯进入河水后，随着水流紊动，一部分将挥发至大气中，另一部分可吸附在泥沙颗粒上，沉入河道底部，进入河底污泥层。由于污泥层中的有机质含量较高，污泥层内的颗粒更加细，因此硝基苯趋向于与污泥更加牢固地吸附，形成累积。当水力条件适宜时，会重新进入水体，或逸入大气，造成生物毒害。

硝基苯类化合物的生物降解性较差，传统上通常采取首先进行臭氧氧化或者铁碳微电解方法处理，使硝基苯的苯环在化学力作用下打开，降低其生物毒性，然后采用微生物好氧处理的方法进一步降解，使其成为低分子量无害物质。这种方法的优点是能确保苯环开环，降低硝基苯对微生物的毒性，提高后续生化处理效率；缺点是流程过长，工艺复杂，成本较高。

为了解决传统处理方法存在的不足，研究者开始尝试寻求利用特异微生物一次完成硝基苯降解的新途径，而实现这一途径必须要首先解决特异微生物的筛选与培养问题。河道底泥中的硝基苯形态稳定，不易脱附，为微生物发挥定向降解作用提供了较好的条件。但遗憾的是，到目前为止，尚没有以河道底泥硝基苯为降解对象，建立对硝基苯具有特异降解能力的微球菌培养方法的文献报道。

发明内容：本发明的目的是提供一株降解河道底泥中硝基苯的微球菌的培养方法，该方法具有流程短、工艺简单、和成本低的特点。

为实现上述目的，本发明首先设计一种富集分离培养基，从河道底泥中分离出一种硝基苯优势降解细菌并进行纯化培养，其具体步骤如下：

1、配制富集分离培养基：富集分离培养基由NaCl、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O、维生素B、硝基苯和水组成，pH为7.0-7.2，先准备5个三角瓶，分别标记为A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶，每个瓶都装等量的富集分离培养基，其中NaCl、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O和维生素B的含量是固定的，它们是(质量百分比)：0.5％NaCl，0.8％K₂SO₄，0.5％MgSO₄·7H₂O，0.01％维生素B，在A瓶、B瓶、C瓶、D瓶和E瓶中，硝基苯的含量依次为(质量百分比)：0.5％、0.4％、0.3％、0.2％和0.1％，水的含量依次为(质量百分比)：97.69％、97.79％、97.89％、97.99％和98.09％。然后将富集分离培养基于111℃下湿热灭菌30min，冷却至常温备用。

2、富集分离培养：首先，按照上述富集分离培养基质量的5％取河道底泥，接种到A瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养36h-48h；培养完成后，在A瓶内取5ml培养液，接种到B瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h-36h；培养完成后，在B瓶内取5ml培养液，接种到C瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h；培养完成后，在C瓶内取5ml培养液，接种到D瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h；培养完成后，在D瓶内取5ml培养液，接种到E瓶中，置28℃-30℃空气浴震荡培养箱中培养24h。这样便获得最终富集培养液。

3、配制纯化培养基：其组分和含量为(质量百分比)：0.1％牛肉膏，0.5％葡萄糖，0.5％NaCl，0.8％K₂SO₄，0.5％MgSO₄·7H₂O，0.01％维生素B，0.1％硝基苯，1.5-2.0％琼脂，95.49％-95.99％水，pH＝7.0-7.2，于111℃下湿热灭菌30min，然后将纯化培养基分别倾倒入8个培养皿中，冷却至常温，使每个培养皿底部均形成均匀的薄层凝固层。