[发明专利]NF－κB位点缺失的DC－SIGN启动子真核质粒的构建方法

权利要求书

1.NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征在于下述步骤：

(1)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点：ACGCGT和AGATCT，用PCR法高保真扩增DC-SIGN启动子片段，并纯化PCR产物，备用；

(2)对DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，得到报告质粒DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic(DSPGB)，并作双酶切鉴定；

(3)在NF-κB结合位点处分别设计5’→3’和3’→5’方向的两条引物PrimerA、PrimerB，两条引物与DC-SIGN启动子NF-κB位点上下两端序列匹配，并且用Ecor I酶切位点替代NF-κB位点；

(4)根据已经构建好的报告质粒DSPGB的序列，在插入的启动子片段上下游分别设计两条引物PrimerC、PrimerD；

(5)分别以PrimerA与PrimerC、PrimerB与PrimerD配对，对DC-SIGN报告质粒DSPGB进行PCR扩增，并用Ecor I对两个扩增片断进行酶切，酶切产物纯化后连接；

(6)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点：ACGCGT和AGATCT，对上述连接产物用PCR法高保真扩增，重新得到NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子片段；

(7)使用Mlu I和Bgl II对上述DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，作双酶切鉴定。

2.根据权利要求1所述NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征在于步骤(1)所述DC-SIGN启动子的一对引物序列如下：

sense primer：ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC，含Mlu I识别位点；

antisense primer：TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG，含Bgl II识别位点。

3.根据权利要求1所述NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征在于步骤(3)所述在NF-κB结合位点处两条引物序列如下：

primerA：5’-GGAATTCGTG ATCTTTACTT CCTAAA 3’，含EcorI酶切位点；

primer B：5-GAATTCCGAAATAAAAGCTGTGGCCCCCA-3’，含EcorI酶切位点。

4.根据权利要求1所述NF-κB位点缺失的DC-SIGN启动子真核质粒的构建方法，其特征在于步骤(4)所述插入的启动子片段上下游两条引物序列如下：

primer C：5-ACAATTTGCC ATTCGCCAT-3(4713-4731)；

primer D：5-ATTCTGTGAT TTGTATTCAG-3(320-301)。