[发明专利]运用环介导恒温扩增技术检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用环介导恒温扩增反应来检测小肠结肠炎耶尔森氏菌，特别是食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌是食品中的常见细菌，可引起极为严重的食品中毒事件，并可以导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康，为各国海关必检微生物之一。快速、准确的检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌是有效预防和控制耶尔森氏菌感染的前提条件。目前食品中的细菌鉴定通常还是利用传统生理生化方法进行检测，利用传统的方法检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌，不仅需要4天的时间进行菌落培养，更要消耗大量的人力和物力，现在已经越来越无法满足进出口货物日益增长的现状。

另外还有一种利用普通的PCR技术进行检测的方法，该方法在设备要求上非常严格，不仅要有价格昂贵的PCR仪，更必须备有电泳装置和相应的实验室，因此不便于广泛推广应用。

随着分子生物学的发展，食品检验检疫工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。最新开发出来的环介导恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。因此如何运用环介导恒温扩增技术检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌已成为食品检验检疫工作中进行攻关的重要课题。

发明内容

为了提高食品检测效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状，本发明经过无数次的实验检测，终于探索出一种运用环介导恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本等特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物用于环介导恒温扩增技术检测；

(2)整合各引物使之不相互干扰。

(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

(4)扩增完毕后可通过短暂离心直接目测白色沉淀检测结果，或通过电泳带形分析检测结果。

本发明用特异性的引物组扩增小肠结肠炎耶尔森氏菌，反应后目测结果和电泳结果均未发现假阳性和假阴性的结果。

该方法包括：应用该方法检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌所使用的引物组和与之配套的扩增反应条件。其中所使用的引物组序列如下：

引物序列一：TCCACTCAGACCCACCAA

引物序列二：ACCGTATCGGCATAACTCATCCTGATACTGCGTGACT

引物序列三：TCTTACGACCGCAGCACAT

引物序列四：TTGCTTTTTATGTGGGGCTATGGAACTAAGCGGGATGGAA

环介导恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分                    浓度        加样量

扩增体系预混合物        2×         12.5μL

引物序列一              10μmol/L   0.2μL

引物序列                10μmol/L   1.6μL

引物序列三              10μmol/L   0.2μL

引物序列四              10μmol/L   1.6μL

DNA样品                             2μL

双蒸水    6.9μL

总体积    25μL

环介导恒温扩增程序为：

(1).61℃  1小时；

(2).80℃  10分钟。

环介导恒温扩增产物检测方法包括：

(1).10,000×g，5分钟，室温，可在试管底部见到白色沉淀；

(2).加入显色剂，反应液呈现绿色；

(3).1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果有为阶梯状电泳条带；

选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。

环介导恒温扩增产物检测理论依据

1、阳性结果会产生白色沉淀：在环介导恒温扩增过程中，dNTP不断添加进新合成的核苷酸链，同时会生成大量的副产物——焦磷酸镁。焦磷酸镁是一种白色沉淀物，由于整个扩增实验都是在61℃进行，所以焦磷酸镁沉淀无法溶解，最终，随着阳性核苷酸链的增加，焦磷酸镁沉淀也不断积累。从而在反应结束后，可以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。