[发明专利]使用放大标记的测序方法

说明书

本申请是中国申请99816103.9的分案申请，该母案于1999年12月23日以国际申请号PCT/GB99/04417提交，于2001年8月9日进入中国国家阶段，本分案采用了与该母案一致的发明名称。

本发明涉及新的测序方法，其中每个碱基所包含的信息被有效地放大，本发明还涉及特别适于测定长核酸分子之序列的方法，其中综合了该序列某些部分的序列信息和有关所述部分在整个序列中所处位置的细节，本发明还涉及实施这些方法所用的试剂盒。

自从Watson和Crick于1953年阐明DNA分子的结构以来，遗传学研究人员一直想寻找快速而经济的，测定各个DNA分子之序列的方法。Sanger/Barrell和Maxam/Gilbert在1975年至1977年间开发出两种新的DNA测序法，它们代表着测序技术的主要突破。目前广泛使用的所有方法都基于Sanger/Barrell的方法，其后23年DNA测序的发展或多或少是对此方法的改进。

然而，1988年，DNA测序技术获得了全新的关注。由美国牵头，1 8个国家共同参与了可能是科学史上最大的单项计划，即对3×10⁹bp的完整人类基因组进行测序(人类基因组计划，也称为HGP)，另外还对几个其它较小基因组进行测序。目前看来，该计划将在2003年完成。尽管该计划牵扯到很多的科研人员，并耗费了大量资金，但人们认为该计划的成果非常重要，足以证明其物有所值。

该计划的重要部分是开发新的DNA测序法，与目前使用的技术相比，新方法的花费应更加合理，速度应更快。原则上，可将这些方法分成基于凝胶的(主要是Sanger/Barrell方法的新变法)和不基于凝胶的技术。不基于凝胶的技术可能具有更大的潜力，目前正在试验的一些方法是：质谱法，流式细胞术，和使用与小DNA分子杂交的基因芯片。比现行方法好得多的方法对基因研究和现代医学而言都是一场变革，因为它们可为深入检测患者基因提供机会，并且在鉴定和开发药物方面起重要作用。这些方法的经济效益自然很大。

已证实，使用目前已知的测序技术难以延伸每个测序反应所能读出的序列长度，目前使用的大多数方法局限于每个测序反应仅读出约7-800个碱基对。目前广泛使用的方法也无法在一个测序反应中对一个以上的序列进行测序。

为了测序多个序列或长序列，一般必需进行很多平行测序反应(例如为了测定长为6万亿个碱基对的二倍体人类基因组序列，必需进行几百万个平行测序反应)。这是很影响测序进程的一个环节，因为工序的总数，酶和试剂的使用，所需独特引物的数目等经常与需进行的测序反应的数目直接成比例。另外，经常需要耗费人力物力来测定重叠序列。此外，必须进行不同类型的组织工作，例如建立和分选DNA文库。如果在其它序列中发现可能的靶序列，还必须花费人力物力来分离该靶序列。

为了阐明限制测序反应长度的主要问题，可以将目前使用的和处于开发中的测序方法适当地分成两大组(也有个别方法不在此分类范围内，但它们仅为极少数)。第一组方法基于多核苷酸的大小范围。起点是制备一个或多个多核苷酸序列梯，其中所有分子都具有一个共有的和一个任意的末端。例如，经典的Sanger和Maxam-Gilbert测序方法基于4个序列梯，它们各代表4个碱基A，C，G和T。

有关可读的测序反应长度的限制因素是：人们必须能区分仅有一个单体差异的多核苷酸。序列梯中的多核苷酸越长，多核苷酸之间的大小相对差异越小。因此，测定分子大小的大多数方法很快就受到限制，此时已不能区分两个相邻的多核苷酸。

另一组方法基于不同的原理。通过鉴定靶分子中存在的序列短片段，可利用序列片段之间的重叠重构靶序列。

因此，在很多测序方法中，将靶分子裂解成较小的片段，推定每个片段的组成，通过发现重叠序列来组建原始序列。例如，已产生了具有65,536个地址的微列阵，其中每个地址含有独特的八聚体。因此覆盖了所有的八聚体排列(4₈＝65,536)。随后，如果用荧光标记靶分子，并使靶分子与八聚体杂交，通过登记已被荧光标记的地址，即可得到有关靶序列中存在何种序列片段的信息。

有关可读的测序反应长度的重要限制因素是下列组合问题。为了能够重构靶序列，所进行的测序反应越长，序列片段也应越长。然而，需检测的排列数目随待鉴定序列片段的长度的增加而呈指数增加。这样就相应地增加了对微列阵上独特地址的需求。