[发明专利]一种A型口蹄疫亚单位疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法，特别是用于预防因A型口蹄疫病毒引起的动物疾病的疫苗，以及这种方法制备的疫苗。更确切讲本发明是一种亚单位疫苗的制备方法和这种亚单位疫苗。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的严重疾病。口蹄疫有7个血清型，型间无交叉免疫。虽然该病的死亡率不高(幼畜除外)，但造成动物生产性能下降约30％，由此带来的贸易限制和卫生处理等费用难以估算，对社会经济和政治的影响极为严重。疫苗接种是预防FMD的有效手段，安全有效的疫苗则是预防、控制以及完全消灭FMD的先决条件。目前我国使用的FMD疫苗是灭活疫苗，灭活疫苗在预防和控制FMD上占有主导地位，但由于存在病毒毒力返强、病毒灭活不彻底等因素，研制更安全有效的新型口蹄疫疫苗势在必行。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用逆转录病毒载体表达A型口蹄疫病毒结构蛋白和3C蛋白酶制备A型口蹄疫亚单位疫苗的方法，从而获得安全、高效的口蹄疫基因工程疫苗。

本发明的A型口蹄疫亚单位疫苗的制备方法是：设计引物与模板并用聚合酶链式反应分别制备出口蹄疫病毒的P12X基因和3C基因，再将所得到的P12X基因和3C基因插入到逆转录病毒表达载体多克隆位点，构建成含有融合基因的重组逆转录病毒表达载体，将构建正确的重组逆转录病毒表达载体和含VSV-G基因的质粒载体通过脂质体共转染至包装细胞GP2-293，在包装细胞内形成假病毒，再用假病毒感染幼仓鼠肾细胞(BHK-21)，将假病毒基因组中含有的P12X3C基因整合到幼仓鼠肾细胞的基因组中并表达结构蛋白和蛋白酶3C。

在本发明的的A型口蹄疫亚单位疫苗的制备方法，其特征是聚合酶链式反应中所用的引物为：

P12X基因扩增上游引物：

5′-CGCGGATCCGCCACCATGGGGGCCGGGCAGTCCAGC-3′

        BamH I酶切位点

P12X基因扩增下游引物：

5′-CCGGAATTCCATGTCCTCCTGCATCTT-GC-3′

        EcoR I酶切位点

3C基因扩增上游引物：

5′-CCGGAATTCAGTGGTGCTCCGCCGACCGACT-3′

         EcoR I酶切位点

3C基因扩增下游引物：

5′-CCGGAATTCCTCGTGATGAGGCTCGGGGTC-3′

         EcoR I酶切位点

所用的模板为口蹄疫病毒AV88(L)GF₈₄MF₁毒株。

前述本发明的A型口蹄疫亚单位疫苗的制备方法中，所指的P12X基因是口蹄疫病毒的部分结构蛋白P1和连结于其后的完整的2A和部分2B的非结构蛋白，其具体的基因序列参见所附的基因序列表。

本发明的疫苗为以本发明的方法制备的A型口蹄疫亚单位疫苗。

基因工程亚单位疫苗是利用DNA重组技术在某种高效表达系统表达某种病原体的免疫抗原基因，选用的原基因多为与病毒中和反应相关的囊膜蛋白或衣壳蛋白基因。口蹄疫病毒P1结构蛋白基因编码为4种主要衣壳蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)，而P2非结构蛋白基因编码的2A能够催化P1-2A同2C解离。P3非结构蛋白基因编码的3C可将病毒蛋白P1-2A前体裂解。有实验证明，FMDV结构基因和非结构基因2A、3C串联起来表达，可以产生76S的类病毒粒子，提纯该类病毒粒子，用来免疫动物，其免疫效果类似于全病毒。因此在基因选择上我们采用了P12X+3C的组合方式，其中2X是2A后面连入了部分2B，2A为P1-2A间裂解提供识别序列，口蹄疫病毒初级裂解发生在2A/2B间，形成P1-2A前体。在2B上也带有部分裂解位点，关于这一点可参见中国农业出版社2004年出版的《口蹄疫》，谢庆阁主编，p28。