[发明专利]编码青霉素结合蛋白的基因和生产L－谷氨酸的方法

说明书

本申请是申请日为1999年3月5日，申请号为99805655.3，发明名称为“编码青霉素结合蛋白的基因和生产L-谷氨酸的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及通过发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被广泛用作调味品等的原料。

背景技术

如果在含有有限量生物素的培养基中培养棒状杆菌(coryneformbacteria)，那么该细菌生产显著量的L-谷氨酸。另一方面，如果在含有过量生物素的培养基中培养棒状杆菌，那么该细菌不产生L-谷氨酸。然而，已知即使在这种条件下，如果向所述培养基中加入表面活性剂或诸如青霉素的生物素活性抑制剂，所述细菌的生长受到抑制，它们也开始生产显著量的L-谷氨酸。

对于通过向培养基中加入青霉素来诱导谷氨酸产生，已经研究了很多年(T.D.Nunheimer，J.Birnbaum，E.D.Ihnen和A.L.Demasin，Appl.Microbiol.，20，215-217(1970))。人们认为青霉素的作用是引起细胞表层的结构变化，从而提高细胞质膜对谷氨酸的通透性。

另外，也已经研究了有限的生物素量或加入表面活性剂或青霉素通过何种机制影响棒状杆菌的L-谷氨酸生产能力，已经阐明存在被认为参与了L-谷氨酸生产的基因(dtsR基因)。而且，已经证实，其中dtsR基因被破坏的菌株即使在下述条件下也产生显著量的L-谷氨酸，在所述条件中生物素的存在量使得野生菌株几乎不生产L-谷氨酸(国际专利公布WO95/23224)。

而且，已经获得了许多同细胞质膜通透性提高诱导谷氨酸生产的解释相矛盾的发现，但仍不了解青霉素诱导谷氨酸产生的机制(E.Kimura，Y.Kawahara和W.Nakamatsu，Tanpakusshitu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid and Enzyme)，第42卷，2633-2640页(1997))。

另外，众所周知青霉素结合蛋白(PBP)在细菌细胞分裂中起重要作用。认为所述青霉素结合蛋白是存在于细菌细胞表层的酶，并且它们特异性结合诸如青霉素的β-内酰胺类抗生素。尽管它可以根据物种有所不同，但认为它是通常在大肠杆菌(E.coli)中发现的3-8种蛋白，它们的分子量分布在大约40,000-120,000的范围内。青霉素通过结合所述青霉素结合蛋白活性位点的丝氨酸残基抑制酶促反应。

已经阐明了7种存在于大肠杆菌中的青霉素结合蛋白，大肠杆菌尤其是研究的主要目标(B.G.Spratt，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，72，2999(1975))。其中，已经证实称为PBP2和PBP3的那些蛋白在细胞分裂中起重要作用(B.G.Spratt，J.Bacteriol.，131，293(1977))。然而，还不知道在棒状杆菌中是否存在青霉素结合蛋白。

本发明的公开

本发明的发明人研究了在棒状杆菌中是否也应当存在青霉素结合蛋白(下文简写为“PBP”)，并分析其功能。结果，本发明人获得到了一个被认为用于阐述青霉素在棒状杆菌中诱导谷氨酸产生的机制的新发现，同时，他们发现该发现可以从仍未知的着眼点用于涉及棒状杆菌的谷氨酸生产能力提高的研制。

以前述发现为基础实现本发明，它涉及生产L-谷氨酸的方法，包括以下步骤：在液体培养基中培养棒状杆菌，以在该培养基中生产和累积L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，其中PBP在所述细菌中通常不起作用，且所述细菌具有产生L-谷氨酸的能力。

在本发明的一个优选的实施方案中，在前述方法中使用的棒状杆菌是其中在第一温度PBP通常起作用，而在第二温度PBP通常不起作用的细菌，所述方法包括在所述细菌增殖的第一温度培养所述细菌的步骤和在L-谷氨酸产生的第二温度培养所述细菌的步骤。

在本发明的另一个实施方案中，在前述方法中使用的棒状杆菌含有包含编码PBP的基因(PBP基因)和温度敏感复制控制区的质粒，其中在染色体上的PBP基因不起作用，而所述质粒在所述第一温度可以复制，而在所述第二温度不能复制。

在本发明的另一个实施方案中，由在所述方法中使用的棒状杆菌产生的PBP具有温度敏感型突变。

在本发明的再一个实施方案中，当PBP结合青霉素G时，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示的PBP分子量约为60,000。

本发明的第二方面是编码在下述(A)或(B)中定义的蛋白的DNA：

(A)具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白；