[发明专利]一种双羰基还原酶、其基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及一种双羰基还原酶的基因；同时涉及该基因在催化手性醇合成中的应用。

背景技术

手性醇是一类重要的中间体化合物，广泛应用于手性药物和其他手性精细化学品的合成。目前，采用生物催化合成这类化合物是一种有效的方法，即将含有羰基的底物通过特定的酶催化还原为相应的手性醇。

然而，当底物中含有两个或两个以上手性羰基时，生物催化反应会因为酶的立体选择性问题而带来较大的困难。以3，5-双羰基-6苄氧基-己酸乙酯为例，该化合物的β，γ位上含有两个羰基，存在立体选择性问题。对此，美国发明专利US5324662报道了一种微生物Acinetobacter calcoaceticusATCC33305能立体选择性地还原上述底物，反应式如下：

但该发明专利并没有分离出其中的活性酶和基因。随后，Guo等人在文献Tetrahedron：Asymmetry，2006，17，P.1589-1602中报道了在Acinetobactersp.SC13874中存在三种不同的羰基还原酶并对其进行了纯化，其中，还原酶III表现出了与整体微生物相似的催化活性和底物选择性。虽然上述文献给出了三段短肽序列，但对该酶的完整基因及蛋白质序列尚一无所知。此外，对于该酶是否能直接催化双羰基一步直接还原成单一手性双羟基产物也无直接证据。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的基因及其蛋白质序列，其可以通过基因表达后大量产生具有高度立体选择性的双羰基还原酶，用以直接还原在β，γ位上含有双羰基的己酸酯类生成单一非对映异构体的手性双醇。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列与SEQ ID NO.1具有80％以上的同源性。

进一步的技术方案是，双羰基还原酶的基因，它的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一种双羰基还原酶，由与SEQ ID NO.2具有80％以上的同源性的氨基酸序列组成。

进一步的技术方案，所述双羰基还原酶，由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成。

上述双羰基还原酶在催化双羰基化合物还原成双羟基产物反应中作为催化剂的应用。

所述双羰基化合物由以下化学通式表达：

其中，R¹选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；

R²选自烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。

所述的双羟基产物由以下化学通式表达：

其中，R¹是芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂环基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基；

R²是烷基、环烷基、卤烷基或卤化烷基。

其制备方法是：从Acinetobacter calcoaceticus ATCC33305的基因组中克隆双羰基还原酶的基因；应用合适的表达载体将该基因在大肠杆菌中有效地表达重组蛋白质；采用合适的检测方法测定该酶的催化功能和性质。

上述技术方案中，所述的基因是指由四种核苷酸碱基排列组合成一定长度的序列；所述的蛋白质是指由20种氨基酸排列组合成一定长度的序列；所述的酶是指具有催化活性的蛋白质。

根据现有的公共知识，任何基因经操作或改造后再接到各种表达载体上，然后导入宿主细胞中，其启动子在适当的诱导剂或外界条件变化时可诱导产生过量的蛋白质。用于表达的载体既可来源于商业途径，也可来自通过DNA重组技术构建。宿主细胞可以是像大肠杆菌、链霉菌等原核细胞，也可以是像酵母菌、CHO等真核细胞。

任何基因通过DNA重组技术可以改变其序列，从而产生各种不同的突变体。这些突变体所表达的蛋白质通常具有类似的性质。当基因或蛋白质序列达到一定的同源性时，它们所表达的蛋白质的性质随同源性增加而更为相似。本发明涉及的基因及其产物也具有相同的特点。当同源性达到80％以上时，类似基因所表达的蛋白质将会具有催化双羰基化合物还原为双羟基化合物的性质。

本发明所涉及的基因是通过DNA重组技术从细菌Acinetobactersp.ATCC33305的染色体中克隆，并经连接在pET22b(+)表达载体后在大肠杆菌中过量表达。经过量表达的双羰基还原酶在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD，其最佳反应pH为6.0，有效作用的pH范围为4.5～7.0，并且在20～50℃均具备良好的催化活性。