[发明专利]一种人尿激肽原酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学和药物化学领域。具体而言，本发明涉及人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)的结构组成、酶学性质及制备方法。

背景技术

1909年，Abelous和Bardier观察到：将人尿中一种水不溶成分注射到麻醉的犬中，其血压下降。1929年，Frey和Kraut从尿液中分离出该物质，还发现其在胰腺中有较高的浓度，认为胰腺为其主要合成场所，被命名为“kallikrein”。1937年发现kallikrein的蛋白酶功能，认为其为一种新蛋白，不是单独起作用，而是一个系统的一部分(Werle et al.，1937)。研究表明，从人尿中来源的该物质为组织型的激肽原酶。

众多研究者从人尿中分离制备了人尿激肽原酶，并进行了大量研究，但其多为两个或者两个以上组分的混合物。

现有技术纯化的人尿激肽原酶SDS-PAGE电泳测定有两条带，一条约43,000Da，一条约39,000Da。根据电泳的条件或计算方法的不同，得到的两个SDS-PAGE电泳条带分子量也有所不同，有40000Da和34000Da；41000Da和31000Da等，实际上是人尿激肽原酶中的两种组分，这两种组分的理化性质非常相似，分离十分困难，无论用抑肽酶或慈菇蛋白酶抑制剂作配基的亲和层析，还是用离子交换层析，均无法将两个组分完全分离；当两个组分混合在一起时HPLC图谱显示出一个单峰，所以用凝胶过滤的方法也无法将两个组分分开。在以前的纯化人尿激肽原酶方法中，一些研究未提及有两个组分。用HPLC的方法或不敏感的电泳方法无法分辨两个组分。

人尿激肽原酶具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用，促进缺血区新生血管生成，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血液粘稠的作用。本申请人的在先专利申请“ZL02116783.4人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用”、“ZL200410088441.8人尿激肽原酶在制备脓毒症药物中的应用”、“ZL200410088440.3人尿激肽原酶在制备急性冠脉疾病药物中的应用”公开了它的三种医药用途。在“ZL 200410096060.4一种用于提高人尿激肽原酶稳定性的药物组合物”中公开了它制备药物制剂的一种方法。

由于以上的研究均采用抑肽酶或慈菇蛋白酶抑制剂作配基的亲和层析，得到的人尿激肽原酶产品为两种以上蛋白组分的混合物，对研究和应用带来很多限制。

人尿激肽原酶具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用。表明了人尿激肽原酶改善血液循环的同时会引起血压的下降。研究表明含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品会引起血压的明显下降，既用现有技术获得的表明含有SDS-PAGE电泳单两条带的人尿激肽原酶药品临床使用是会有更大的副作用。

药品的活性成份如果含有两个组分，而这两个组分的比例无法控制，对于药品的疗效和安全性也就无法控制。因此，生产SDS-PAGE电泳单一条带的药品活性成份是非常重要的。

日本株式会社三和化学研究所是世界上最先将人尿激肽原酶用于人的临床研究的公司，他们的人尿激肽原酶药物仍然含有SDS-PAGE电泳测定的两个条带；比活性不低于5 PNA单位/毫克·蛋白(PNA U/mg·protein)。他们的人尿激肽原酶药物最终没能获得批准。(特開平5-163158.人尿性キニノゲナ—ゼを有効成分とすゐ皮膚潰瘍の予防及び治料劑.)

能够发现人尿激肽原酶SDS-PAGE电泳测定有两条带，并且能有效地将这两种物质分离，得到SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶的研究未见报导。

发明内容

本发明的目的通过一种层析材料，并结合其他层析技术，从人尿中分离出SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶。这种人尿激肽原酶在临床使用时副作用小。