[发明专利]β-甘露聚糖酶及基因和制备方法以及载体和宿主细胞

说明书

技术领域

本发明是关于一种β-甘露聚糖酶及其编码基因和制备方法，以及含有该 基因的重组载体和重组宿主细胞。

背景技术：

甘露聚糖酶是一类能够水解半纤维素中第二大组分——异甘露聚糖的 内切酶，在医药、食品、饲料、造纸、纺织、印染、洗涤、石油开采及生物 技术等诸多领域得到了广泛应用。例如：甘露聚糖酶可作为饲料酶添加剂， 饲料中添加甘露聚糖酶可补充内源消化酶不足，消除和降解饲料原料中的抗 营养因子，促进畜禽生长，减少养殖污染(Lee，et al.，Poultry Science，82： 1925-1931，2003)；可水解甘露聚糖型植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶、魔芋等)， 生成具有增殖双岐杆菌生理功效的低聚甘露糖，具有较大的市场前景。

β-甘露聚糖酶的来源非常广泛，细菌中的芽孢杆菌属、气单胞菌属、肠 杆菌属、假单孢菌属和链霉菌属，丝状真菌和酵母，以及高等植物和某些低 等动物中都发现了甘露聚糖酶。各种不同来源的β-甘露聚糖酶，在活性大小 及对环境条件的要求等方面，大多存在或多或少的差别。工业生产一般需要 经过高温过程，所以能够进行工业生产的甘露聚糖酶需要具有一定的耐热性 (最好具有60-70℃的耐热性)。如果要用于饲料或食物添加剂，还需要具备 一定的耐酸性，这是因为尽管消化碳水化合物的主要过程发生在中性微酸的 小肠和其它消化道中，但是食物或饲料还是要经过胃部的酸性环境。目前分 离到的黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710菌株产生的甘露聚糖酶能够较好 地满足以上两点，该酶耐热性能好，工作温度范围是30-85℃，最适反应温 度70℃；反应pH2-9.2，最适pH3.0-3.8(丁宏标等，中国专利CN01144782.6， 2001年)。然而，黑曲霉AS2710菌株的甘露聚糖酶基因还没有克隆得到， 其表达主要是通过黑曲霉AS2710菌株发酵，该菌发酵周期长(5天以上)， 另外因为没有有效的启动子控制，也不容易实现甘露聚糖酶基因的高效表 达，且该酶没有有效的亲和标签，不利于快速方便地纯化。

发明内容：

本发明的一个目的是克服目前没有适于原核表达且易于纯化分离的耐 酸耐热的β-甘露聚糖酶的缺陷，提供一种适于原核表达且易于纯化分离的耐 酸耐热的β-甘露聚糖酶。

本发明的第二个目的是提供编码该β-甘露聚糖酶的基因。

本发明的第三个目的是提供含有该基因的重组载体。

本发明的第四个目的是提供含有该重组载体的宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供所述β-甘露聚糖酶的制备方法。

本发明提供了一种β-甘露聚糖酶，该β-甘露聚糖酶具有SEQ ID：NO.2 所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.4所示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.6所 示的氨基酸序列，SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列，或者对SEQ ID：NO. 2、SEQ ID：NO.4、SEQ ID：NO.6或SEQ ID：NO.8所示的氨基酸序列进 行一个或几个氨基酸取代、缺失或添加而得到的β-甘露聚糖酶活性不变的氨 基酸序列。

本发明提供了一种编码本发明提供的β-甘露聚糖酶的基因。

本发明提供了一种重组载体，该重组载体含有本发明提供的基因。

本发明提供了一种重组宿主细胞，该宿主细胞含有本发明提供的重组载 体。

本发明提供了一种β-甘露聚糖酶的制备方法，该方法包括培养本发明提 供的宿主细胞。

本发明提供的β-甘露聚糖酶能够水解各种含有β-1，4甘露糖苷键的甘露 聚糖，生成寡糖，其最适作用条件是pH 5-5.5，60-65℃，能够作为食物或饲 料添加剂，适应胃部的酸性环境，而且能够满足工业生产对耐热性的需要。 虽然，之前已经分离到的黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710菌株产生的甘 露聚糖酶，具有耐热耐酸性，但是其生产方法是真菌发酵的方法，存在周期 长、产量低的缺点，而本发明提供的β-甘露聚糖酶可以利用本发明构建原核 表达系统进行生产，克服了上述真菌发酵的缺点。另外，本发明中的重组甘 露聚糖酶，表达后具有六个组氨酸标签，纯化十分方便。