[发明专利]刀切引流法制取棉花DNA纤维

说明书

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及一种制备DNA纤维的方法。

背景技术

DNA荧光原位杂交(FISH)技术是70年代末80年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP)，根据DNA-DNA或DNA-RNA碱基配对原则与染色体上相对应的序列杂交。进行原位杂交时，先用高温或碱处理DNA分子，使之发生变性；当温度下降或pH值恢复到中性，变性的DNA会按照碱基互补配对的原则，重新形成氢键恢复到原来的双链结构。如果两条单链的来源不同，只有它们之间的碱基序列是同源互补或部分同源互补时，才能全部或部分复性，产生分子杂交。由于探针带有荧光物质，因此杂交的位点可直接在荧光显微镜下观察到。利用该技术可以检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分折。

随着技术的发展与不断完善，荧光原位杂交在植物上应用与研究的优越性越来越明显：(1)与用放射性物质来标记探针的分子原位杂交相比，它不需要放射性同位素，安全可靠，不需特殊方法处理，检测时间短，背景清晰，检测灵敏度高，底物可长期贮存而不失活；(2)与其它非放射性原位杂交技术相比，它可用不同荧光素标记的探针与同一目的DNA进行杂交，即进行多重标记，一次定位多个DNA序列；(3)杂交信号可逐级放大，进行定量或非定量分析，并且可通过计算机软件图像分析系统检测并处理杂交微弱的信号，使其可视化更强。

FISH技术的发展沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从而衍生出许多FISH新技术，如Multicolor-FISH、CGH、GISH、CISS、BAC-FISH、Chromosome Painting、Reverse ChromosomePainting等等；另一方面则是努力提高FISH技术的分辨率，将靶目标从中期染色体发展到DNA纤维，使其分辨率由1Mb发展到1kb，这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞生物学的一项代表技术。

不同探针的应用方面以基因组为探针的GISH技术可以定位外源DNA片段在染色体上的位置、大小、插入点等。Durnam(1985)首先将GISH应用于体细胞杂种的异源染色体检测。本实验室采用GISH方法对棉花四倍体的起源和进化进行了研究。以不同的荧光素标记探针的多色荧光原位杂交(Multicolor-FISH)，可以同时定位不同探针序列的分布。1990年Nederlof等创建了多色荧光原位杂交技术。他们用生物素、AAF(氨基乙酰荧光素)和CP三种半抗原对不同探针作单、双、三标记，再用这三种半抗原相应的分别标记了异硫氰酸荧光素(FITC，绿色)、氨甲香豆素乙酸(AMCA，蓝色)和碱性蕊香红(TRITC，红色)的抗体来检测荧光，该技术最多可同时观察7个靶染色体。以正常基因组DNA与异常基因组DNA混合为探针，以正常中期染色体为靶目标的比较基因组杂交(comparativegenomic hybridization，CGH)技术可以根据两种探针信号的强度差异找出基因组中DNA增加或缺失的区域。以单一染色体文库为探针，以异常染色体为靶目标的染色体涂色(Chromosome Painting)技术特别适合于检出染色体多体和易位。以显微分离的异常染色体区段为探针，以正常染色体为靶目标的反向染色体涂色技术(ReverseChromosome Painting)可以确定异常染色体区段的来源。以BAC、YAC、cosmid文库为探针，可以同时对多个文库克隆进行定位、定序。运用BAC-FISH技术，现已将抗白叶枯病基因Xa21，棉花rRNA基因、抗稻瘟病Pi25(t)、抗绿叶蝉基因Glh和抗水稻黄萎病RTSV成功地定位到染色体上。直接在靶DNA上以探针为引物进行原位合成的引物原位DNA合成技术(primed in situ DNA synthesis，PRINS)和原位PCR技术(PCR in situ)提高了原位杂交的效率和检测的灵敏度。