[发明专利]水产病原菌群体感应信号分子的检测方法及其专用试剂盒

权利要求书

1、一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测试剂盒，包括根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136，紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026，N-酰化高丝氨酸内酯，X-Gal或ONPG，和大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403。

2、根据权利要求1所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阳性对照菌株液化沙雷氏菌(Serratia Liquefaciens)MG1、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01和费氏弧菌(Vibrio fischeri)MJ1。

3、根据权利要求2所述的快速检测试剂盒，其特征在于：所述N-酰化高丝氨酸内酯为3-OH-C6-HSL、3-OH-C8-HSL、3-OH-C10-HSL、3-Oxo-C10-HSL、C8-HSL、3-Oxo-C8-HSL、3-Oxo-C12-HSL、3-Hydroxy-7-C14-HSL、C4-HSL、3-Hydroxy-C4-HSL和3-OH-C12-HSL中的一种或一种以上任意组合。

4、一种水产革兰氏阴性病原菌群体感应信号分子的快速检测方法，包括将受试菌进行如下所述四项实验：

1)将所述受试菌与报告菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136在同一添加了X-Gal或ONPG的固体平板上共同划线培养；所述添加了X-Gal的固体平板中X-Gal的浓度为30-80μg/ml，所述添加了ONPG的固体平板中ONPG的浓度为40-80μg/ml；观察根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)A136菌体是否显示蓝色，如果显示蓝色即为阳性，反之为阴性；

2)将所述受试菌与报告菌株紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026在同一固体平板上共同划线培养，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色，如果显示紫色即为阳性，反之为阴性；

3)将所述受试菌划线接种于含浓度为400-600nmol/L N-酰化高丝氨酸内酯的LB平板上培养24-48小时，再将报告菌株紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026分别在受试菌划线旁平行划线，观察紫色杆菌(Chromobacterler violaceum)CV026菌体是否显示紫色变浅或褪去，如果显示紫色变浅或褪去即为阳性，反之为阴性；

4)将所述受试菌与报告菌株大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403在固体平板上共同划线培养，观察大肠杆菌(Escherichia coli)pSB403菌体是否发光，如果发光即为阳性，反之为阴性；

上述四项实验中，如果至少有一项实验显示阳性，则判断受试菌产生N-酰化高丝氨酸内酯群体感应信号分子，反之，则判断受试菌不产生感应信号分子。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法中，还包括将检测表明产生N-酰化高丝氨酸内酯群体感应信号分子的受试菌进行大量培养，提取N-酰化高丝氨酸内酯信号分子用薄层色谱法进行定性检测；受试菌大量培养用培养基为ABT培养基，所述ABT培养基为含有0.4g/L(NH₄)₂SO₄、0.6g/L Na₂HPO₄、0.3g/L KH₂PO₄、0.3g/L NaCl、1mmol/L MgCl₂、0.1mmol/L CaCl₂、0.01mmol/L FeCl₃、2.5mg/L硫胺、质量百分含量为0.5％葡萄糖和质量百分含量为0.5％酸水解酪素的培养基；所述提取N-酰化高丝氨酸内酯信号分子的方法是用在受试菌培养液的上清液中加入乙酸乙酯萃取得到N-酰化高丝氨酸内酯。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述受试菌是从病鱼和/或养殖水体和/或养殖底泥中分离获得。