[发明专利]人胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hES细胞)的生物学特性，获得类似早期胚胎的球体结构-拟胚体(embryoid body，EB)，以地塞米松和人胰岛素联合I型胶原的方法，实现体外定向高效诱导人胚胎干细胞分化为肝细胞的技术。

背景技术

由各种原因(病毒、药物、肿瘤及遗传性疾病等)引发的终末期肝病严重威胁人类健康。目前，它的治疗主要依赖于原位肝移植，但是，供体的极度短缺、移植及手术本身相关的死亡、终生服用免疫抑制剂及其所致的致死性并发症等一系列问题极大的限制了这一治疗手段的广泛开展。肝细胞移植和生物人工肝作为肝移植的辅助方式，可以部分缓解上述问题，但其来源细胞同样也面临着存活期短，难以大量扩增，特别是随着培养时间的延长，肝功能逐渐降低等问题，因此，寻求合适的肝细胞来源已属迫在眉睫。

通过胚胎干细胞分化定向诱导获取肝细胞是解决肝细胞来源的有效途径。从不同角度来分，胚胎干细胞分化的分类方法有很多种，例如以诱导剂的不同分类、以分化过程的不同分类等，其中，以分化过程可分为：1.胚胎干细胞自发分化；2.胚胎干细胞直接以诱导剂诱导其分化；3.胚胎干细胞先形成拟胚体(即EB)，之后将一个个球形EB(含有众多细胞、具有三维结构)直接接种，再添加各种诱导剂来诱导分化。其中，1998年，人ES细胞的成功建系打开了体外生产可供移植治疗的所有类型的人体细胞、组织乃至器官的大门。因此，体外定向诱导人ES细胞分化为肝脏细胞成为目前研究的热点(Lavon N，Benvenisty N.Study ofhepatocyte differentiation using embryonic stem cells.Journal of CellularBiochemistry，2005，96：1193-1202.)。

EB是ES细胞在体外一定条件下自发形成的类似早期胚胎的球体结构，其三胚层的形成与分化基本模拟了体内胚胎早期发育中组织细胞分化的过程，可以作为研究哺乳动物胚胎发育尤其是早期谱系决定、胚层相互诱导等现象的理想体外模型。然而，现有的诱导分化方法是将EB作为一个球体直接接种，这样会使细胞层叠，既不利于充分接触，操作中也只能通过其周边爬出的那些细胞来进行形态观察，因此，现有的诱导分化方法还有必要改进。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改进的人胚胎干细胞体外定向诱导分化为肝细胞的方法。使该方法在操作中便于形态观察，同时让细胞与因子和胞外基质能够充分接触，从而能有效地以及快捷地诱导出肝细胞。

为实现上述目的，本发明人胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞的方法，采用以下步骤：

1)扩增人胚胎干细胞；

2)形成成熟拟胚体；

3)将诱导的成熟拟胚体消化成单个细胞；

4)将单个细胞以条件培养液诱导分化，得到肝细胞。

上述方法中，更具体的步骤包括：

1)采用胶原酶IV消化法对hESCs进行传代扩增，获得大量干细胞；

2)将hESCs用拟胚体培养液悬浮、培养，接种到低吸附性的细菌皿中形成成熟拟胚体EB；

3)将成熟的囊性EB用胰蛋白酶消化为单个细胞；

4)将单个细胞后接种到预先包被有I型胶原的组织培养皿，以含有地塞米松和人胰岛素的条件诱导液培养，通过观察鉴定得到肝细胞。

其中，所述步骤1)具体过程为：将人ES细胞系，接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，37℃，5％CO₂条件下培养，培养液为无血清人ES细胞培养液：DMEM培养基、含20％血清替代物、1％非必需氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM谷氨酰胺、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子bFGF、50IU/mL青霉素、50IU/mL链霉素，每天更换培养液；培养一周后，用1mg/mL胶原酶IV在37℃条件下孵育10～20分钟进行消化传代，离心，重悬，以1∶4～1∶6接种于新的培养皿，获得汇合生长的大量干细胞。