[发明专利]一种重组植物病毒的物理灭活方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组植物病毒的物理灭活方法。

背景技术

目前，重组植物病毒的灭活方法很多，包括加热法、巴斯德灭菌法、辐射法、光化学法和紫外光照射法等，除了这些物理方法外，还有很多化学试剂作用的方法，这些化学试剂包括碘、臭氧、表面活性剂、氮丙啶、甲醛、β-丙内酯和光敏复合物等，但都存在适用范围的局限性，例如：有些化学试剂属于致癌物质，对人体有害。紫外线也具有一定灭活作用，它能导致病毒多核苷酸形成二聚体，从而抑制其复制。但经紫外线照射的病毒具有在可见光照射下重新复性的可能。光化学灭活方法中，不同的光敏剂具有不同的靶目标。如亚甲基蓝(methylene blue，MB)和苯胺蓝(toluidine blue)既可与病毒核酸作用，同时也可与病毒包膜上的脂质和蛋白质结合。所以这种方法可能对重组病毒的外源小肽产生影响。而⁶⁰Coγ射线被认为可以灭活所有类型的病毒，所以，植物病毒也不例外。但到目前为止，⁶⁰Coγ射线用于植物病毒的灭活还未有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组植物病毒的物理灭活方法，在对外源小肽不破坏或破坏很小的前提下，解决潜在生物安全性隐患。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组植物病毒的物理灭活方法，其特征在于采用⁶⁰Coγ射线对重组植物病毒进行辐照灭活。

上述的重组植物病毒配制成浓度不大于20μg/μl的病毒溶液，所用的⁶⁰Coγ射线的辐照剂量范围为14kGy～30kGy，温度为4±0.5℃。

上所述的重组植物病毒为重组烟草花叶病毒。

上述的重组烟草花叶病毒是采用外源展示法，将外源蛋白插入到烟草花叶病毒外壳蛋白CP的羧基末端，与CP形成融合蛋白，而形成的重组烟草花叶病毒。

上述的重组烟草花叶病毒是在CP蛋白第152～158位氨基酸之间，插入外源小肽。

上述的灭活方法，在高效灭活重组病毒粒子的前提下，对重组病毒外源多肽的后续利用无影响。

附图说明

图1.不同剂量率⁶⁰Coγ射线灭活后的TMVS1241稀释成1μg/μl的浓度，分别接种抗性烟草，三天后接种叶片的症状。枯斑消失说明病毒已灭活。

图2.不同剂量率⁶⁰Coγ射线灭活后的TMVS1241与未灭活的TMVS1241接种抗性烟草后，枯斑比例分析图。枯斑比值越小，说明病毒粒子的相对侵染力越小，病毒灭活效果越好。

图3.不同剂量率⁶⁰Coγ射线灭活的TMVS1241稀释成1μg/μl的浓度分别接种敏感烟草，接种两周后烟草新叶的症状。花叶症状消失说明病毒已灭活。

图4.不同剂量率⁶⁰Coγ射线灭活的TMVS1241接种敏感烟草三周后，对新叶总RNA进行RT-PCR检测，引物分别为Pst(-)和Acc2(+)。若检测不到重组病毒基因组条带，说明病毒已灭活。

M：1Kb DNA marker

lane 1：正对照(以pTMV为模板)

lane 2：正对照(以pTMVS1241为模板)

lane 3：负对照(以H₂O为模板)

lane 4：MOCK(健康烟草新叶)

lane 5：0kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 6：4kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 7：6kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 8：8kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 9：10kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 10：12kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 11：14kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 12：16kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 13：18kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 14：20kGy剂量辐照后TMVS1241

lane 15：30kGy剂量辐照后TMVS1241

图5.不同剂量率⁶⁰Coγ射线灭活的TMVS1241接种敏感烟草三周后，对新叶总蛋白进行SDS-PAGE检测。若检测不到病毒CP特征性条带，说明病毒已灭活。

M：MOCK(健康烟草)