[发明专利]定量检测小颗粒低密度脂蛋白的方法

说明书

本申请为2005年8月5日提交的200380109553.0号中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及分级定量检测小颗粒低密度脂蛋白的方法，其对于动脉硬化的临床诊断是重要的。

背景技术

低密度脂蛋白(LDS)在血液中胆固醇运输中起重要作用并且是动脉硬化的危险因素。公知小颗粒低密度脂蛋白(下文中“小颗粒LDL”)在LDL中颗粒尤其小并且比标准LDL密度更高，并且与正常LDL相比，使动脉硬化的危险性增加数倍。小颗粒LDL的增加是动脉硬化的主要危险因素之一。分级检测小颗粒LDL在临床上非常重要。

检测小颗粒LDL的常规方法使用超速离心、电泳、高速液相层析，等等。超速离心方法通过使用密度的不同分离小颗粒LDL，并检测其中的胆固醇和蛋白质的量。小颗粒LDL在1.040到1.063之间的密度被分级分离(Atherosclerosis，48，33-49页，1993：Atherosclerosis，106，241-253页，1994，等)。然而，该方法需要昂贵的设施，并且检测很耗时。电泳方法使用聚丙烯酰胺凝胶检测LDL的运动性和颗粒直径。小颗粒LDL的颗粒大小低于25.5nm(JAMA，260，1917-21页，1988，等)，并且LDL的相对运动性(从VLDL到LDL的移动距离除以从VLDL到HDL的移动距离)不小于0.4(Domyakukoka(alteriosclerosis)，25，67-70页，1997)。然而，这些方法用于检测LDL中小LDL颗粒的程度，并且它们不用于得到定量检测。而且，一次可以试验的样品数受到限制，并且进行检测耗费很长时间。最近，发明了检测脂蛋白的方法。在该方法中，电泳后，对琼脂糖凝胶进行脂质染色，并使用计算机分析染色图案，并得到脂蛋白的定量检测(日本专利公开号2000-356641)。这是用于分析变性LDL，如经氧化的LDL、乙酰化LDL、糖基化LDL、MDA-LDL等的方法。通过该方法不能准确检测小颗粒LDL。因为该分析需要非常昂贵的设备，该方法不适于一般用途。

通常，在HDL的检测中，公知聚阴离子与二价阳离子的组合可用作分离试剂用以通过凝聚不同于HDL的脂蛋白而分离HDL。例如，使用硫酸葡聚糖-Mg²⁺(Clin.Chem.28，1379-88页，1982，等)、肝素-Mn²⁺(J Lipid Res.19.65-76页，1978，等)、肝素-Ca²⁺(Arch.Biochem.Biophys.170，334-40页，1975，等)和磷钨酸-Mg²⁺(Clin.Chem，23，882-84页，1977，等)的方法等是公知的。此外，已经报导了使用一些分离试剂通过脂蛋白的逐步沉淀计算LDL和VLDL的级分的方法(日本专利公开号7-294532，Rinsho-Byori，特别版21，82，1975，等等)。此外，还报导了使用聚乙二醇分离HDL的方法(Ann.Clin.Biochem.18，177-8l页，1981)。

此外，还有常规方法，如使用多种分离试剂通过脂蛋白的逐步沉淀，基于浊度的不同检测每种脂蛋白的方法(Rinsho-Byori，特别版2l，82，1975，等等)，和根据不同的离子强度悬浮或者溶解小颗粒LDL并通过吸光度的不同检测小颗粒LDL的方法(日本专利公开号2003-28882)。然而，因为检测光吸光度，所以特异性和准确度不足。

专利文件1日本专利公开号2000-356641

专利文件2日本专利公开号7-294532

专利文件3日本专利公开号2003-28882

非专利文件1 Atherosclerosis，48，33-49页，1993

非专利文件2 Atherosclerosis，106，241-253页，1994

非专利文件3 JAMA，260，1917-21页，1988

非专利文件4 Domyakukoka，25，67-70页，1997

非专利文件5 Clin.Chem.28，1379-88页，1982

非专利文件6 J Lipid Res.19.65-76页，1978

非专利文件7 Arch.Biochem.Biophys.170，334-40页，1975

非专利文件8 Clin.Chem，23，882-84页，1977

非专利文件9 Rinsho-Byori，特别版21，82，1975