[发明专利]激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种可激发机体对鼠疫产生免疫力的融合蛋白及其编码基因与其在制备鼠疫疫苗中的应用。

背景技术

耶尔森氏鼠疫杆菌(Y.pestis)是一种革兰氏阴性菌，属于enterobacteriacae家族，直接或间接(通过跳蚤)在动物之间传播。该菌会引起某些动物(如老鼠、松鼠或旱獭等)的慢性病，若从这些动物传播到其它动物则会引起这些动物的急性病，即鼠疫。

鼠疫是一种烈性传染病，近年来感染人数有不断上升的趋势。在人类中传播的鼠疫有三种。腺鼠疫是其中最常见的形式，通常由感染了鼠疫的跳蚤叮咬人引起。细菌从叮咬位置传播到流经的淋巴结点，引起肿大，可以有一个鸡蛋大小，是腺鼠疫的典型特征。如果没有形成肿大，就会发展成败血病鼠疫，特征是发热、伤寒、头痛、虚弱和肠胃不适。正是因为症状的大众化，导致患者常被误诊，死亡率很高。最可怕的是当细菌在肺泡中增殖导致肺炎，就成为肺鼠疫。肺鼠疫导致了相当高传染性的血痰，咳嗽导致含有细菌的飞沫传播到易感人群，在极短的时间内(1-3天)就可发病，具有高死亡率和高传染率的特点。同时由于其可能作为潜在的生物恐怖武器而引起了各国政府和人民的高度关注。

鉴于目前还没有治疗肺鼠疫的特效药，同时也为了防御可能的生物恐怖袭击，研制有效的预防鼠疫的疫苗成为当前生命科学研究的重要领域。迄今为止，已经生产并使用了多种药物和疫苗来预防鼠疫，并已取得了令人鼓舞的效果。过去常用疫苗和抗生素来预防和治疗鼠疫。其中，链霉素就是一种很好的治疗腺鼠疫的药物。但抗生素在治疗败血型鼠疫和肺鼠疫过程中很少成功，可能是因为疾病发展太快，而且治疗必须是在疾病发生的早期阶段。而免疫接种死疫苗需要一个超过六个月的免疫过程。因此，死疫苗主要用于那些可能暴露于致病原的人员。研究认为这种疫苗对预防腺鼠疫感染有一定效果，但因副反应较大后来停止使用，如1961-1971年在侵越美军中使用的USP疫苗。Baca-Estrada等(Baca-Estrada ME，Foldvari MM，Snider MM，et al.Vaccine.2000，18(21)：2203-11.)采用脂质体过滤甲醛溶液灭活的全菌体死疫苗(KWCV)给小鼠进行鼻腔内接种，然后测定免疫抗体和免疫细胞，并用气溶胶攻击，结果显示，用脂质体过滤的KWCV较单独用KWCV引起的粘膜免疫显著增强，经测定肺部和鼻腔洗液中的特异分泌性IgG和IgA抗体，以及肺内分泌特异性抗体的细胞均有明显增加。另外，在脂质体疫苗免疫的小鼠中，不仅脾细胞特异性增值，分泌TNF-γ的细胞也显著增加，经鼻腔免疫的小鼠对鼻腔感染攻击也有明显的保护作用，证明了粘膜免疫对于抗吸入性感染的重要性，以及脂质体剂型可以改进传统疫苗的免疫效果。

EV76减毒活疫苗是阴性染色的耶尔森氏菌突变株，它起源于耶尔森氏菌全毒菌株。自1908年起开始使用这种疫苗，用EV76疫苗免疫小鼠诱导免疫应答能够抵抗皮下和呼吸道攻击，研究结果表明：用EV76疫苗免疫能够保护人抵抗腺鼠疫和肺鼠疫。然而，这种疫苗对人的安全性还存在疑问，据报道在研究鼠疫疫苗的研究人员中这种疫苗的致死率约为1％。

近年来，研究人员主要集中发展用亚单位疫苗预防鼠疫，这是基于毒性因子可能定位于细菌表面，因此用这些成份免疫小鼠可以诱导产生保护性抗体，这些抗体在III型分泌系统中起调节作用。

粘膜免疫系统(mucosal immune system)与系统免疫系统(systemic immunesystem)是机体的两大免疫系统，两者至少在两个方面具有不同的免疫功能。一是粘膜免疫常常激发粘膜和系统免疫应答，而系统免疫仅仅激发系统免疫反应，不激活粘膜免疫系统或很弱；二是粘膜免疫反应主要产生sIgA，而系统免疫不产生或产生很少的sIgA。

但是绝大数非复合抗原(如纯蛋白质抗原)经粘膜供给时免疫原性弱，特别是经口服途径，只有大量和反复接种后才可能引起免疫应答，且应答持续时间短，易引起免疫耐受。寻找能够增强疫苗粘膜免疫原性的粘膜佐剂成为粘膜疫苗开发中的关键问题。比较理想的粘膜佐剂应高效、安全，能激活粘膜免疫系统，在其存在的情况下抗原经粘膜供给可引发抗原特异性全身和粘膜的体液和细胞介导的免疫应答，同时能避免诱导粘膜耐受。抗原对粘膜免疫系统有效的刺激是产生sIgA的必要条件，对粘膜免疫系统的有效刺激需要两个条件，一是疫苗抗原能够有效的传递到粘膜淋巴组织；二是需要合适的粘膜佐剂。

在许多情况下，鼻腔免疫更为有效，而且所需的疫苗量和佐剂量一般较小。