[发明专利]一种分枝杆菌噬菌体的保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域和微生物制品领域，具体涉及一种新的噬菌体保存方法。

背景技术

随着分子生物学技术的发展，噬菌体已广泛应用于疾病的诊断，并用于疾病治疗的研究。在耐多药结核病(MDR-TB)成为结核病第三次大流行的原因之一时，快速诊断结核病、快速药物敏感性试验和结核病的新疗法已成为当今研究热点。利用噬菌体生物扩增法(PhaB assay)以及荧光素酶报告噬菌体(Luciferasereporter phage)的方法快速检测结核菌和药物敏感性试验在最近得到开发，亦有人认为有必要将细菌的天敌——噬菌体作为治疗耐药细菌感染性疾病的手段。随着噬菌体技术用于疾病快速诊断以及噬菌体作为一种有希望治疗细菌感染性疾病的生物武器，尤其在耐多药结核菌不断增加的形势下，研究分枝杆菌噬菌体的扩增和保存方法十分重要。

发明内容

本发明提供了一种分枝杆菌噬菌体的新型保存方法，所述的方法是以无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂，真空冷冻干燥后保存。

将噬菌体采用真空冻干后4℃和室温保存后比较，总体上4℃优于室温；而采用不同保护剂时，保存效果相差较大，当采用噬菌体宿主菌破碎制成的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂时，冻干后室温或4℃保存，28周内效价均只下降10¹，保存效果理想。同时，用无细胞耻垢分枝杆菌疫苗作为保护剂保存的分支杆菌噬菌体因含有无细胞耻垢分枝杆菌疫苗而具有良好的免疫刺激作用，利于分枝杆菌噬菌体对结核病的治疗。

附图说明

图1液体法用不同保护剂、保存温度对噬菌体效价的影响A→E分别代表不同保护剂：7H9(10％OADC)+30％甘油、7H9(10％OADC)+1mmol/LCaCl₂、7H9(10％OADC)+10％甘油+1mmol/LCaCl₂+0.05％叠氮化钠、SM、4％小牛血清白蛋白；1代表保存温度为4℃，2代表保存温度为-70℃。

图2冻干法用不同保护剂、保存温度对噬菌体效价的影响A→G分别代表不同保护剂：10％灭菌脱脂牛奶、7H9(10％OADC)+1mmol/L CaCl₂、4％小牛血清白蛋白、SM、7％无细胞耻垢分枝杆菌菌苗(MS)蛋白、3.5％MS蛋白、1.75％MS蛋白；1代表4℃保存，2代表室温保存。

图3无细胞耻垢分枝杆菌菌苗免疫小鼠的脾脏T淋巴细胞体外培养产生的IFN-γ(N.S指生理盐水对照组，M.S指耻垢分枝杆菌菌苗免疫组)

*：指脾脏T淋巴细胞体外以PPD刺激时，耻垢组与对照组比较p＜0.05

具体实施方式

到现在为止，已经给出了本发明的一般性描述。借助于下列实施例，参照特定的实施方案，以下给出更详细的说明，目的是为了更好地理解本发明的目的、特征、优点和操作方法。然而，无意于将本发明的范围限定在此范围内。在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1：分枝杆菌噬菌体的增殖和收集方法

本实施例详细说明了噬菌体的具体增殖和收集方式。

1.1增殖方式

分别采用单层和双层Dubos琼脂培养基，单层培养基与双层培养基的上层均含有10⁶PFU噬菌体和1mg耻垢分枝杆菌。37℃培养24、48h后，分别取上层培养基于研磨器中加9mlSM(镁盐液)液研磨，然后4℃4000rpm离心20min，上清再用0.2μm无菌滤器过滤，得到的噬菌体扩增液进行效价检测。

1.2.不同噬菌体/宿主菌比例对增殖效率的影响

采用琼脂双层法，培养基上层加不同比例的噬菌体(PFU)/宿主菌(CFU)：10⁵/10⁹、10⁵/5×10⁸、10⁵/10⁸、10⁶/10⁹、10⁵/5×10⁸、10⁵/10⁸、10⁷/10⁹、10⁷/5×10⁸、10⁷/10⁸、10⁸/10⁹。37℃培养48h后采用孵育-过滤法收集扩增的噬菌体，并进行效价检测。

1.3噬菌体的收集