[发明专利]丙型肝炎病毒体外复制模型及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及丙型肝炎病毒体外复制模型及其构建方法与应用，属于病毒学技术及医药生物技术领域。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，简称：HCV)是单股正链RNA病毒，属黄病毒家族。HCV引起的丙型肝炎是一种严重威胁人类健康的传染病，全球统计有1.7亿人受到感染，而且每年新增300～400万例患者。由于HCV容易变异，迄今还没有疫苗问世，这使得丙型肝炎的危害从某种意义上说比乙肝更为严重。

现有技术中，丙型肝炎病毒基因组长约9.6kb，由相对较长的5’NCR(341nt)、一个大的开放读码框、较短的3’NCR及polyA或polyU构成。HCV的5’NCR在所有HCV分离株中是最保守的区域，属非编码区，含有内在IRES，它可能介导多聚蛋白前体的帽非依赖性翻译，属调控单位；同属非编码区的3’NCR对HCV的复制起重要作用。编码区含有结构蛋白和非结构蛋白，仅有一个起始密码子，翻译成一个多聚蛋白前体，由病毒和宿主的酶分别对该蛋白进行切割；其中，来自宿主的酶切割ns3编码的NS3病毒酶类，再由病毒酶类对其它蛋白进行切割；ns5b基因编码病毒的NS5B蛋白，具有RdRp活性，是HCV复制的关键酶。HCV在细胞内的复制是以正链为模板复制出其中间体负链，再以负链为模板复制出其正链，因此HCV负链的存在是HCV复制的标志。

现有技术中，HCV在被感染组织和血清中浓度较低，长期以来缺乏合适的细胞培养系统和实用的动物模型。

HCV体外感染细胞模型对于深入认识HCV病原学特点、病毒复制机制及致病机理、HCV保护性抗原的鉴定、疫苗研制及特异性抗HCV药物筛选等是极为重要的工具。为此，国内外学者作了大量探索，主要有HCV感染细胞模型和HCV转基因细胞模型两大类。HCV是一种嗜肝性病毒，人们首先选用肝源性细胞来建立模型；此外，临床上发现HCV还可以侵犯肝外组织如外周血细胞、肾细胞、精子细胞等。但这些HCV复制模型中，普遍存在复制率低、周期长、不能用常规核酸杂交技术检测病毒复制，而仅靠RT-PCR测定正、负链的合成。另外，人们试图加强复制采用基因转染的方法构建的HCV复制模型大都没有肯定的病毒颗粒形成。因此提高HCV在体外培养细胞中的感染率，尤其获得能够传代培养的适应体外细胞培养的毒株，为HCV复制机制、药物筛选和疫苗研制提供接近自然感染状态的理想细胞模型是本领域内研究人员急需解决的课题之一。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种接近自然感染状态的丙型肝炎病毒体外复制模型。

本发明提供的丙型肝炎病毒体外复制模型，是感染了人丙型肝炎病毒的体外培养细胞，其中的丙型肝炎病毒来自丙型肝炎患者血清。该丙型肝炎病毒体外复制模型是人丙型肝炎病毒多次在宿主细胞上活化、传代而获得的具有较高复制率的感染细胞。所述宿主细胞为哺乳类细胞，包括肝源细胞、淋巴源细胞、肾源细胞、精子细胞等。其中优选宿主细胞为肾源细胞、肝源细胞、淋巴源细胞。

本发明的另一个目的在于提供一种构建丙型肝炎病毒体外感染复制模型的方法。

本发明提供的丙型肝炎病毒体外复制模型的构建方法，是通过以下技术方案实现的：

1.选择一种病毒接种方法，将1个及以上丙型肝炎病毒感染患者血清混合，以振摇法进行接触、吸附，以离心法进行培养。

2.选择一种培养基，该培养基含有促进丙型肝炎病毒复制的铁离子。

3.选用感染细胞裂解上清液反复感染正常宿主细胞，经多次培养以获得具有较高感染率、能引起细胞形态改变的丙型肝炎病毒毒株。

本发明所述的丙型肝炎病毒体外感染模型的构建方法，具体有如下步骤：

(1)筛选接种物；

(2)筛选敏感宿主细胞株；

(3)进行病毒接种与培养；

(4)优化病毒培养条件；

(5)细胞培养适应毒株的获得；

其中所述步骤(1)是将一个或一个以上丙型肝炎病毒感染患者血清混合；所述步骤(2)中的敏感宿主细胞为哺乳类细胞，包括肝源细胞、淋巴源细胞、肾源细胞、精子细胞的一种；所述步骤(3)是以振摇法常温进行接种，吸附后，离心法进行培养；所述步骤(4)是常规细胞培养基成分中含有10-300μM的铁离子；所述步骤(5)是HCV感染细胞裂解上清液反复感染正常宿主细胞，并经多次培养以获得体外细胞培养适应毒株。