[发明专利]用发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷的毛状根的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、生理学、育种学以及基因工程等领域，涉及一种利用转基因技术获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的方法，具体涉及发根农杆菌遗传转化粘毛黄芩并获得产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根的具体程序。本发明还提供利用基因工程技术获得的产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根及其培养的子代。

背景技术

植物次生代谢产物具有极其复杂的化学结构，至今仍没有找到有效的或经济的合成方法。相对于常规细胞培养，毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定、向培养液释放部分代谢产物等优点。由于Ri质粒转化的毛状根生长快，易于培养，有效成分高，具有表达完整的代谢通路，为药用植物次生代谢产物的工业化生产提供了广阔前景。

目前，虽然国内外采用发根农杆菌遗传转化药用植物获得生产次生代谢产物的毛状根的相关研究较多，但对遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷毛状根的研究仍是空白。粘毛黄芩属于唇形科黄芩属多年生药用草本植物。该属植物约300多种，世界广布，我国有100种以上，可作为黄芩药用者约有7种左右，粘毛黄芩就是其中的一种。该植物主要药用成分为黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等黄酮类化合物，现代药理学证实其具有清热解毒、止血安胎、抗菌消炎、保肝利胆、降压脱敏、防晒美白等作用。随着国际上对黄芩苷等研究的持续升温和认识的逐步深入，认为黄芩苷在清除氧自由基、减轻组织的缺血再灌注损伤、调节免疫、促进细胞凋亡以及抗肿瘤和HIV等多方面均有作用，具有重要的药用价值和开发利用前景。然而目前获得粘毛黄芩的主要技术是人工栽培，但存在生产周期长、成活率低、农药残留超标和有效成分较低等弊端，使得该方式商业前景尚不明朗。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种转基因技术遗传转化粘毛黄芩获得产黄芩苷毛状根的方法，该方法将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入粘毛黄芩中，获得粘毛黄芩毛状根；

本发明的另一方面，还提供了一种用上述方法转化的宿主细胞，这种经转化的宿主细胞发育为毛状根。在实例中该宿主细胞是粘毛黄芩

本发明的技术方案如下：

一种获得产黄芩苷粘毛黄芩毛状根的方法和利用该方法获得的产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根，该方法步骤如下：

(1)采用任何可能的手段获得无菌的粘毛黄芩；

(2)采用任何转基因方法转移发根农杆菌的Ri质粒的T-DNA到粘毛黄芩细胞、组织、器官、植株中；包括以下步骤：

A、活化发根农杆菌；

B、发根农杆菌浸染粘毛黄芩外植体；

C、发根农杆菌与粘毛黄芩外植体的共培养，步骤如下：

I、将侵染后的粘毛黄芩外植体接种在MS+AS 100μmol·L^-1固体培养基上；

II、置于温度为25℃±1.0℃恒温暗培养1～5天

D、外植体的除菌培养；

(3)在特定的条件下筛选和鉴定毛状根，方法如下：

I、提取粘毛黄芩毛状根DNA

II、获得含rolB和rolC引物的PCR反应体系；

III、PCR反应扩增毛状根特有基因rolB和rolC；

IV、电泳检测目标条带；

(4)在适合的条件下培养粘毛黄芩毛状根，用于生产黄芩苷。

用上述方法获得的生命体，它是可生产黄芩苷的粘毛黄芩毛状根。

在本发明中，术语“生命体”指粘毛黄芩的细胞、组织、器官、植株。

在本发明中，术语“任何转基因方法”包括发根农杆菌Ri质粒介导遗传转化、基因枪法介导的遗传转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。

在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指用在离体培养的条件下根据毛状根特殊的形态学特征初步鉴定转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。

在本发明中，术语“在适合的条件下培养粘毛黄芩毛状根”是指对经过鉴定的粘毛黄芩毛状根离体培养，并检测黄芩苷的含量，筛选黄芩苷含量提高的优良转化子进行培养，获得其后代。

在本发明中，利用转基因技术，将发根农杆菌Ri质粒的T-DNA导入粘毛黄芩细胞获得转化毛状根，通过筛选优良无性系，获得黄芩苷及其相关黄酮类化合物含量相对较高而稳定的毛状根无性系，为黄芩苷的生产提供一种新型优质的可持续使用的药源。

具体实施方式