[发明专利]基于线粒体DNA T6680C单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病检测用的试剂盒，具体涉及基于线粒体DNA T6680C单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒。

背景技术

高原肺水肿(high altitude pulmonary edema，HAPE)是一种特发于高原低氧环境的肺水肿，是严重威胁进入高原人群健康和生命的急性重症高原病。该病起病急，进展快，如果救治不及时，可在较短的时间内发展至呼吸衰竭，甚至死亡。文献报道，在进入海拔3600多米的高原汉族人群中，高原肺水肿的发病率高达0.4％-2％。HAPE发病的有明显的家族和个体易感倾向，这提示我们遗传因素在HAPE发病机制中的发挥着重要的作用【张雪峰，高原施工人群急性重型高原病患病率调查，《高原医学杂志》，2005；15(3)：7-8；陈有，高原肺水肿发病机制研究进展，《高原医学杂志》，2005，15(2)：62-64；高钰琪，高原肺水肿的发病机制及防治，《人民军医》，2005；482(2)：108-111】。

由于线粒体是低氧习服和适应中起着极其重要的作用，HAPB是一种习服不良的急性高原病，因而线粒体在HAPE的发生中发生着重要的作用【高文祥，低氧大鼠脑线粒体体外转录活性的研究，《中国应用生理学杂志》，2001；17：323-326；Moudgil R，Hypoxic pulmonary vasoconstriction，《J ApplPhys iol》，2005；98：390-403】。单核苷酸多态性(SNP)，是一种新型的分子遗传标记，广泛应用于复杂疾病的易感性预测[Kato，Mitochondrial DNApolymorphisms in bipolar disorder，《J Affect Disord》，2001，62：151-164】。

LDR(连接酶检测反应)是一种经济、快速的检测SNP常用的方法，其检测原理是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别，高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。测序分型原理如下：

(1)本技术方案先通过PCR(聚合酶链反应)获得含有待检测突变位点的基因片断，然后进行LDR，最后通过测序仪电泳读取检测结果；

(2)检测结果表明，左边位点，即突变位点一为A/C杂合子，右边位点，即突变位点二为T纯合子(见图1)。

LDR与传统的SNP分型手段相比，LDR技术有多项优势：

(1)准确度高：与PCR等技术的假阴性假阳性相比，LDR技术可以比较准确的对SNP进行分型；

(2)操作简单：和目前的PCR技术相似，LDR反应操作简单，对技术人员没有特殊的专业要求；

(3)成本低：使用LDR检测系统只需现有的PCR仪等分子实验室仪器即可，无需再投入大量的资金购置设备；

(4)通用性强：成熟的LDR检测系统适用于各种SNP位点的分型；

(5)高通量：LDR检测系统可同时对多达上百个SNP位点进行分型，检测效率高，满足复杂疾病及药物基因组学的诊断需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于线粒体DNA T6680C单核苷酸多态性检测高原肺水肿易感性的试剂盒，能用于高原肺水肿(简称HAPE)易感者的筛选，指导HAPE的预防。

发明人通过对206例汉族HAPE患者和144例汉族健康对照的线粒体DNA(mtDNA)的第6680位点SNP进行对比分析，研究mtDNA的SNP与HAPE的相关性，寻找出了敏感可信的HAPE易感生物遗传标记。步骤是先通过对26例汉族无关个体的mtDNA的全长扩增，测序，初步提示mtDNA的6680位点为汉族人mtDNA的高频位点。然后利用mtDNA的10398位点多态性，通过RFLP(限制性片断长度多态性)将所有标本分为单倍群M和N。再通过(PCR聚合酶链反应)-LDR(连接酶检测反应)反应在大样本中(单倍群M和N)检测mtDNA T6680CSNP与HAPE的相关性。在单倍群M中，mtDNA的6680C在HAPE病例组频率为12.2％，在汉族对照组中的频率为1.7％(P＝0.028)。结论：单核苷酸多态性6680C是HAPE发病的危险因素，可以作为HAPE的遗传标志之一。因此，基于该SNP位点，可以设计适当长度的引物与探针，用于PCR-LDR检测高原肺水肿的易感性。