[发明专利]聚乙二醇修饰的抗菌/中和内毒素变构肽分子、其合成方法及医学用途

权利要求书

1.聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子，其特征在于：具有下列结构通式，Y-BNEP-Z-amPEG

其中，Y是氢或其它修饰基团，包括但不限于酰基、C1-C18烷基、芳基苄基、烯丙基；Z是各种连接基，包括但不限于-NH(CH₂)nCO-(n＝1-8)、-NH(CH₂)nX(n＝1-10，X＝O，S，NH，etc)，或者没有连接基；amPEG的分子量包括但不限于2000，4000，6000，12000或20000。

2.根据权利要求1中所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子，其特征在于：表现为多肽的药学上可接受的各种无机酸或有机酸的盐类。

3.根据权利要求1中所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子，其特征在于：表现为多肽的链中或端位环肽。

4.根据权利要求3所述的抗菌、抗内毒素变构肽分子，其特征在于：表现为各种多肽的链中或端位环肽的药学上可接受的各种无机酸、有机酸的盐类。

5.权利要求1-4任一项所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子用于制备治疗或预防内毒素脓毒症、脓毒性休克疾病或症状药物的用途。

6.权利要求1-4中所述的聚乙二醇修饰的抗菌、中和内毒素变构肽分子的合成方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)、母体肽树脂合成通法

称取Fmoc-Lys(Boc)-CTC树脂或其它多肽合成氨基酸树脂倒入合成柱中，加入溶剂DCM、DMF或DCM/DMF溶胀，以10％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，检测后抽滤至干，用DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶；称取抗菌/中和内毒素变构肽BNEP的氨基酸序列C端第二个氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH于适宜的容器中，加入DMF溶解，然后加入偶联剂和氮甲基吗啉或二异丙基乙胺的DMF溶液；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤肽树脂；加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除氨基酸树脂的Fmoc保护基团，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，除尽六氢吡啶；按照常规多肽固相化学合成方法，依照中国授权专利01104591.4中的BNEP9901315的氨基酸序列进行后续偶联，如此循环完成整个BNEP肽链的合成，得到母体肽树脂充分洗涤，MeOH收缩，抽干，从合成柱中取出合成的肽树脂，冻干机中冻干，备用；

(2)、氮端衍生物制备

将母体肽树脂倒入合成柱中，加入溶剂溶胀，抽干，加入20％-50％六氢吡啶的DMF溶液脱除Fmoc，洗涤后加入酰基化试剂的DMF溶液，搅拌或通氮气或振荡，控温；偶联完成后，除去反应液，以DCM、MeOH、DMF、DCM、DMF依次洗涤，抽干，从合成柱中取出合成的BNEP肽衍生物树脂，置冻干机中冻干，得

(3)、BNEP-amPEG分子的合成

选择采用以下两种方法之一：

(3.1)从自制amPEG开始的逐步合成法

(3.1.1)全保护制备通法

脱除Fmoc圆底烧瓶中加入设计量的Fmoc-AAn....AA₁-amPEG，其中n＝2，3...14，15-50％六氢吡啶的DCM溶液，控温搅拌30-60min；旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，DCM-EtOH/Et₂O重结晶两次，P₂O₅真空干燥得去Fmoc保护的AAn....AA₁-amPEG，其中n＝1，2，3...13；

偶联圆底烧瓶中加入的AAn....AA₁-amPEG，其中n＝1，2...13，2倍量的保护氨基酸Fmoc-AAx-OH，其中x＝2，3...14，0.02倍量的催化剂DMAP和DCM，溶解后加入的DIC；20-40℃油浴中电磁搅拌，TLC检测反应过程；反应毕，停止反应；旋蒸，无水乙醚析出沉淀，抽滤，无水乙醚洗涤3次，DCM/Et₂O或DCM-EtOH/Et₂O重结晶2次，茚三酮监测，应与空白颜色相同或相似，P₂O₅真空干燥得全保护的肽树脂Fmoc-AAn....AA₁-amPEG，其中n＝2，3...14，称重计算收率；重复上述脱除Fmoc、偶联操作，实现14个氨基酸的偶联，得到全保护称重计算收率；

3.1.2)BNEP-amPEG制备

A.Fmoc-BNEP-amPEG制备 全保护1g，冰冷下加入10mL裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v，电磁搅拌2-4h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降，离心；DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得侧链无保护Fmoc-BNEP-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品，用氨基酸组成分析等方法确证结构；

B.BNEP-amPEG制备将1g全保护除去Fmoc保护基后，按上述A法裂解去侧链保护，沉降、离心、重结晶后得全去保护的BNEP-amPEG粗品；该粗品以适量水溶解，乙醚沉降，离心得固体；再重复2次，得较纯品；HPLC纯化，冻干，得纯品；用氨基酸组成分析等方法确证结构；

或，(3.2)从自制的片段合成法

A.脱除树脂  计算量母体肽树脂加入三氟乙醇裂解试剂，r.t反应60-120min，过滤，DCM、THF洗涤树脂，收集滤液，减压旋蒸到没有液体蒸出；加入H₂O，析出大量白色固体，加入THF溶解固体，加饱和食盐水溶液，分液，减压旋蒸THF层得白色固体，真空干燥，得除去CTC树脂的全保护

B.偶联amPEG全保护加入DMF和THF，搅拌溶解后，加入4-6倍HOBt，冰水冷却下加入4-8倍DIC；搅拌，加入含有1-4倍自制amPEG的DMF溶液；撤除水浴，室温搅拌18h后，置于25-40℃油浴搅拌反应，TLC跟踪反应进程；反应结束，转入较大的圆底烧瓶，旋蒸除去THF，冷却后加入冷冻的无水Et₂O，搅拌，静置。抽滤，无水Et₂O洗涤，真空干燥。上述产物加入DCM，搅拌全溶后加入冷冻无水Et₂O，搅拌，抽滤，无水Et₂O洗涤，真空干燥，得到全保护

C.除去Fmoc全保护加入piperidine的DMF溶液，25-40℃油浴搅拌反应，反应结束后转入较大的圆底烧瓶，加入冷冻的无水Et₂O，搅拌，抽滤，无水Et₂O洗涤，真空干燥；上述产物，加入EtOH，搅拌全溶后加入冷冻无水Et₂O，搅拌，抽滤，无水Et2_O洗涤，真空干燥，得到侧链全保护的

D.裂解去保护  侧链全保护冰冷下加入裂解试剂TFA/Thioanisole/EDT/anisole 94∶3∶2∶1，v/v，，电磁搅拌2-3h，氮气吹去大部分TFA，无水乙醚沉降，离心；DCM溶样，无水乙醚沉降，离心分出固体；再重复2次，冻干，得BNEP-amPEG粗品，HPLC纯化、冻干，得纯品。