[发明专利]蛇足石杉(Huperzia Serrata (Thunb.)Trev)的一种内生真菌

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种其发酵产物含石杉碱甲的微生物。

技术背景

随着社会人口的老龄化，老年性痴呆症发病率相对上升，据统计，当今世界有5000多万老年人患有不同程度的老年性痴呆症。我国60岁以上人口预计道2010年将占总人口的15.7％，痴呆症问题同样是我们所面临的不可回避的问题。因此寻找治疗老年性痴呆病的有效药物已受到各国的高度重视，成为当务之急。近年来，国内外学者在应用天然药物有效成分治疗老年痴呆病方面做了大量基础研究和临床应用研究工作由于脑中胆碱能系统受到了损害，导致突触部位乙酰胆碱含量的下降，从而对病人的学习、记忆能力产生影响。因此，针对提高老年性痴呆病人脑中的乙酰胆碱含量，促进胆碱能神经功能的药物应运而生。石杉碱(huperzine A)为我国首创的可逆性强效乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂.是近年来从石杉属植物蛇足石杉(Huperzia Serrata(Thunb.)Trev)中分离得到的一种新的生物碱对老年性痴呆症，单纯记忆障碍以及重症肌无力症治疗有显著疗效，且药效持续时间长，无严重不良反应，是国内外上述病症最有效的药物，深受关注，在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一。

但石杉碱甲生产还是依赖于从蛇足石杉植株中提取。其缺点是：1.石杉碱甲含量很低。2.生产周期长。3.生产效率低。4.人工栽培困难。5.蛇足石杉植株生长缓慢。6.破坏野生资源及生态环境。7.生产成本高。现在虽有关于蛇足石杉细胞培养及化学合成来生产石杉碱甲的报道，但存在大规模植物细胞细胞培养难度高，生长缓慢，成本高，产量低等缺点；而石杉碱甲结构复杂，化学合成反应步骤多、污染大、条件苛刻、产率极低、毒副作用大、成本高，而无法商业化生产。石杉碱甲用微生物发酵方式获得尚未见任何形式的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种其发酵物具有药用功能的木霉菌。

本发明所述的霉菌命名为木霉属，木霉菌(Trichodermasp.)，编号D01。保藏在国家知识产权局指定保藏单位，保藏编号为：CGMCC No.1905

本发明所述的木霉菌D01系从石杉科植物蛇足石杉(Huperzia Serrata(Thunb.)Trev)植物活体中分离得到的。现保藏在国家知识产权局指定保藏单位保藏，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.1905

本发明所述菌株的固体培养特征：

1.PDA培养基28℃培养4天，菌落直径30mm，7天蔓延整个培养皿。菌丝白色，平长茸状，生长紧密，边缘不齐，背面淡黄色。

2.麦芽汁培养基28℃培养4天，菌落直径30mm，7天蔓延整个培养皿。菌丝白色，生长紧密，边缘不齐，背面淡黄色。

本发明所述木霉菌D01液体发酵培养；

1.培养基PDA。摇床培养时间5-7天。培养温度28℃±2℃。

2.发酵培养特征：培养第一天，菌种有零星的白色菌丝点；培养第二天长满白色菌丝；培养第5-7天发酵液中长满白色菌丝体。

3.木霉菌D01液体发酵5-7天后，对发酵液进行化学提取、分离可得到胆碱酯酶抑制剂-石杉碱甲。

本发明所述的木霉菌D01液体发酵提取工艺为：菌种→种子培养→发酵培养→发酵物提取→分离化合物→石杉碱甲。

上述步骤中，发酵原料为马铃薯培养基(PDA)。

上述的------液态发酵工艺中，发酵条件参数如下：

(1)发酵方式：液态发酵。

(2)菌种斜面：试管斜面菌种培养采用马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA)。

(3)种子培养：种子培养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)。

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)制备：取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤弃去马铃薯，滤液加水补至1升，加入葡萄糖20克，pH值自然。

上述马铃薯葡萄糖培养基中加入琼脂15克，即为固体PDA培养基。

(4)发酵培养：发酵的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)，pH值自然。

(5)培养时间：种子摇床培养时间48-72小时，发酵培养时间5-7天。

(6)培养温度：种子摇床培养温度28℃±2℃，发酵培养温度为28℃±2℃。

(7)发酵物提取：发酵完毕，过滤，收集菌体和发酵液。发酵液用有机酸浸提、萃取、反萃取、脱色和重结晶等技术分离得到石杉碱甲。