[发明专利]人肝素酶的RNA干扰靶点序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及2个人肝素酶的RNA干扰靶点序列，由于这2个干扰序列经过克隆入载体，转入肿瘤细胞后可使肿瘤细胞中人肝素酶蛋白在转录后水平表达明显下调，从而使肿瘤在转移，血管生成等各方面受到明显抑制。因此本发明所涉及的干扰序列可以用于制备有关抗肿瘤的药物。

背景技术

1999年，澳大利亚的Parish阳以色列的Voldavsky同时首次克隆并鉴定出与肿瘤转移密切相关的肝素酶基因(HPA)。HPA定位于4号染色体q21.3位置，其cDNA包含的长度为1629bp的开放阅读框编码含543个氨基酸分子量为61.2KD的多肽。其表达产物属内β-D-葡萄糖苷酶，能特异性识别、切断硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS)侧链。HSPG是细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的主要成分之一，在组织构成、血管形成和细胞粘附等诸多方面发挥重要的生理作用。高度水化的HS侧链及所带的负电荷形成结构致密的选择性分子筛，是阻止肿瘤细胞侵袭扩散的首要屏障之一，同时，伸展的HS侧链还储备着大量生长因子、趋化因子和酶类等生物大分子。肝素酶促肿瘤转移的机制一方面在于它能降解HSPG，破坏ECM和BM的完整性，另一方面又间接地释放和活化HS结合的多种生长因子，如bFGF、EGF等，促进肿瘤血管形成，为发生转移的肿瘤细胞在局部定植提供营养。HPA基因mRNA在脾脏、淋巴结、胸腺、外周血白细胞、骨髓及胎肝等免疫组织中均可检测到，而在除胎盘以外的成熟非免疫组织(如心脏、骨骼肌及胰腺等)均不表达，但在转移性的恶性肿瘤细胞中普遍存在。包括肝细胞癌、膀胱癌、大肠癌、胃癌、乳腺癌、口腔癌、食管癌、胰腺癌、多发性骨髓瘤、急性髓细胞样白血病等等。所有这些研究发现意味着人肝素酶可能是我们在肿瘤治疗过程中一个新靶点。由于肝素酶在恶性肿瘤中的广泛表达的特性，人们一直在利用各种方法寻找其抑制剂。通过构建携带反义全长人肝素酶cDNA腺病毒载体，人们发现人肺癌A549细胞的体外侵袭能力和体内转移能力都被特异性抑制。同样的发现还有在黑色素瘤细胞的转移和侵袭方面。

RNAi主要是通过在转录后水平阻断基因表达，借此我们可以研究基因的功能。同时它为我们提供了一个治疗疾病的新途径。比如，我们可以按拟定的方式来关闭非必需或致病基因的功能。随着人们对多种生物体基因组序列了解的深入，RNAi技术可以帮助我们更细致的了解复杂的生理学过程。RNAi技术与基因组学、蛋白质组学和功能蛋白质组学密切相关，因此，人们可以利用RNAi开发更多的新药。

随着RNAi现象的发现及其技术的不断成熟和进步，尤其是应用与哺乳动物后。相比传统的基因组学技术，RANi更迅速，更直接，更高效，其在构建基因敲减动物模型和研究遗传疾病中的作用越来越突出。

基于上述研究发现，我们通过构建shRNA载体，利用其较长久稳定的基因敲减作用来研究肝素酶在肝癌HepG2细胞中蛋白表达情况。并且发现经过RNA干扰后，肝癌HepG2细胞中的HPA蛋白表达明显下调，这表明RNA干扰对肝癌HepG2细胞的肝素酶的具有显著的抑制作用。

发明内容

本发明的目的在于提供人肝素酶的2个RNA干扰靶点序列，分别为：

SEQ ID NO：1GGCTATCTCTTCTGTTCAA

SEQ ID NO：2CTCAGTTGCTCCTGGACTA。

通过这2个靶点的RNAi作用，可明显抑制人肝素酶在肿瘤细胞中的表达，因此，本发明的另一目的是关于所述RNA干扰靶点序列及由其获得的siRNA在用于制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的上述2条干扰序列，是通过网络在线工具(www.genscript.com)筛选获得，筛选的原则如下：

1.热力学性质：热力学性质不稳定的序列被筛除。

2.SiRNA靶点长度：预先设置为19个碱基每个序列。

3.靶点的GC含量：预先设置GC含量在40-60％。GC含量低的靶序列(＜60％)比GC含量高(＞60％)的靶序列的干扰效果更好。对于GC含量高的基因，我们可以调整GC含量的上限。

4.靶序列的来源：我们推荐以开放阅读框为我们选取序列的来源。在起始密码子ATG下游50-100nt后选取效果更好。

5.生物体：人、鼠和兔的基因组是当前可利用的。

6.RNA的二级结构：计算RNA二级结构和每个靶点的正义链和反义链的最小自由能。

7.重复序列：去除串联重复序列。

8.去除能触发机体免疫反。