[发明专利]与人MHC－Ⅰ类分子结合的肝素酶多肽表位

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，包括筛选获得与人主要组织相容性复合物I(MHC-I)类分子结合的肝素酶多肽分子，以及编码这些多肽的DNA、RNA，由于这些多肽与人MHC-I类分子的结合位点进行结合，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)，从而有效杀伤肝素酶阳性的肿瘤组织，达到治疗进展期肿瘤的目的。

背景技术

目前的研究表明，CD8⁺T细胞所识别的靶抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以“抗原肽-MHCI类分子”复合物的形式呈现在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位。

1999年，澳大利亚的Parish和以色列的Voldavsky同时首次克隆并鉴定出与肿瘤转移密切相关的肝素酶基因，其表达产物属内β-D-葡萄糖苷酶，能特异性识别、切断硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS)侧链。HSPG是细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的主要成分之一，在组织构成、血管形成和细胞粘附等诸多方面发挥重要的生理作用。高度水化的HS侧链及所带的负电荷形成结构致密的选择性分子筛，是阻止肿瘤细胞侵袭扩散的首要屏障之一，同时，伸展的HS侧链还储备着大量生长因子、趋化因子和酶类等生物大分子。肝素酶促肿瘤转移的机制一方面在于它能降解HSPG，破坏ECM和BM的完整性，另一方面又间接地释放和活化HS结合的多种生长因子，如bFGF、EGF等，促进肿瘤血管形成，为发生转移的肿瘤细胞在局部定植提供营养。体外实验发现，不同转移潜能的乳腺癌细胞株其肝素酶基因表达是不同的，低转移细胞株中测不到肝素酶mRNA表达和蛋白活性，而高转移株中则明显表达。将肝素酶全长cDNA转染至低转移潜能的鼠淋巴瘤和黑色素瘤细胞株后，肿瘤细胞转移能力明显增强，而肝素酶的抑制剂如PI88、硫酸昆布多糖或反义分子则能明显降低肿瘤细胞的转移能力。将肝素酶cDNA转染至低转移潜能的鼠淋巴瘤和黑色素瘤细胞株后，其肿瘤细胞转移能力明显增强，而肝素酶的抑制剂如PI88、硫酸昆布多糖或反义分子则能明显降低其转移能力。综上所述，肝素酶作为肿瘤相关抗原，与肿瘤的转移密切相关，因此临床上可对肝素酶表达阳性且人类白细胞抗原(HLA)配型的进展期肿瘤有一定的杀伤效果。而将肝素酶作为肿瘤相关抗原，采用生物信息学手段，研究其CTL表位，并将其作为肿瘤免疫治疗的一个新靶点，到目前为止，未见有文献报道。

随着对免疫应答分子机制研究的深入，人们已逐渐认识到机体的免疫细胞并不是对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗原表位。蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。

发明内容

本发明的目的是提供能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位。

本发明的另一目的是提供所述多肽表位在制备用于临床治疗和检测肿瘤性疾病疫苗中的用途。

本发明根据抗原肽与MHC-I分子相互作用的机理，从肝素酶的全长基因序列中筛选出侯选多肽表位，最终得到能有效与MHC-I类分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的多肽表位，该多肽表位长度仅9个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。

既往的研究表明，肝素酶mRNA的表达水平与胃癌的生长、浸润及转移密切相关。在此研究的基础上，将肝素酶全长基因序列构建到pDC315腺病毒载体中，并在293细胞内同源重组及扩增后，感染树突状细胞，将负载了肝素酶全长基因的DC细胞作用于T细胞，可以激发特异性的CTL反应。因此，在肝素酶的全长基因序列中，一定存在可以激活T细胞的特异的CTL表位。

根据上述研究，为实现本发明第一目的而采用的技术方案是这样的，即能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的多肽表位，筛选自序列号为：SEQ NO：1的人肝素酶，为与SEQ NO：1的人肝素酶具有同源性的下列氨基酸序列，包括：

SEQ No.68，Pro Ala Phe Ser Tyr Ser Phe Phe Val；

SEQ No.46，Pro Leu Leu Ser Asp Thr Phe Ala Ala；

SEQ No.37，Lys Met Leu Lys Ser Phe Leu Lys Ala；

SEQ No.53，Pro Leu Pro Asp Tyr Trp Leu Ser Leu；