[发明专利]同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒亚型和耐药突变检测领域，尤其涉及一种同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒及检测方法。

背景技术

据世界卫生组织统计，全球大约有3.5亿人携带了乙肝病毒，亚洲携带的人大约是2.2亿。我国是最主要的乙肝大国，2002年我国流行病学调查显示，乙肝表面抗原阳性率9.09％，约1.2亿，慢性乙型病毒性肝炎病人约3000万。目前这类人群正处在发病和治疗的高峰时期。HBV感染呈世界性流行，其基因型分布具有地域性特点，在我国和亚洲以B、C型为主，有少量的D型。目前许多研究结果都表明不同基因亚型的HBV病毒对药物的敏感不同与疾病进程的关系也不相同。例如，一些研究表明基因型C较B更容易引起严重的肝炎或肝癌，对干扰素的应答率A型高于D型，B型高于C型。因此对感染的HBV进行基因分型具有重要的临床意义。核苷类似物是当前公认的抗HBV药物，我国目前使用最多的是拉米夫定和阿德福韦酯。这些药物对多数乙型肝炎病人无法彻底清除体内的HBV，患者需要长期维持治疗，随着这些药物的广泛、长期应用，HBV在宿主体内感染以及抗病毒治疗的过程中会发生变异，并在宿主体内免疫系统的压力下以及在治疗干预过程中进行变异的优势选择，以达到逃逸免疫、对抗药物作用、实现物种生存的目的，随之出现病毒基因变异耐药的问题，病毒基因组序列分析对于发现基因型耐药非常重要，通常耐药变异是某种特定的变异，这种变异株在抗病毒治疗前很少存在。乙肝病毒一旦出现变异耐药后肝功能恶化的比例显著增高，甚至快速进展至肝衰竭。

中国专利200410025199.X和200510065445.9分别公开了一种检测拉米夫定耐药HBV DNA的方法，但利用该方法不能在测定耐药性的同时检测出HBV基因亚型。乙肝患者在治疗期间，临床医师需要掌握感染的乙肝病毒是哪种基因亚型，对抗病毒药物治疗的反应性差异，是否存在拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变。这对指导患者选用何种抗病毒药、是否继续使用该抗病毒药、何时停用或换用何种抗病毒药都有很现实的临床意义，对病人抗病毒治疗的疗效判断、预后评估十分重要。至今为止国内外未见同时检测HBV基因分型和两种常用药耐药的产品和报道，因此临床上如果需要获得全面的参考信息，病人需要做多项检测，大大加重了病人的经济负担。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变检测试剂盒及检测方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的试剂盒，所述试剂盒包括：

1)特异性扩增乙型肝炎病毒基因或转录本的引物，其碱基序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

2)乙型肝炎病毒基因亚型特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；

3)乙型肝炎病毒耐药突变特异性寡核苷酸探针，其碱基序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17所示；

上述所有序列可由其碱基互补序列替换。

所述寡核苷酸探针固定在基质上。

所述寡核苷酸探针固定在尼龙膜上。

所述引物标记生物素。

一种同时检测乙型肝炎病毒基因亚型和耐药突变的方法，包括以下步骤：

1)制备血清，提取乙型肝炎病毒DNA；

2)以步骤1)所得乙型肝炎病毒DNA为模板，利用权利要求1所述特异性扩增乙型肝炎病毒基因或转录本的引物进行PCR扩增；

3)上述PCR产物与固定在基质上的权利要求1所述全部探针序列杂交；

4)洗膜及显色。

所述PCR扩增体系为： 10×buffer    2.5μL

                    Primer 1      10pmol

                    Primer 2      10pmol

                    Template      0.1ng

dNTPs     50μM

TaqE      2.5U